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Chap. 5 : Purification des protéines

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3) Moyens de purification: filtration centrifugation



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Établir un protocole de purification c'est sélectionner et enchainer plusieurs techniques d'extraction et d'isolement. A chaque étape de purification



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purification des protéines (1); il s'agit notamment des techniques suivantes : • précipitation; ? électrophorèse isoélectrofocalisation;

  • Comment purifier une protéine ?

    Lorsque la température approche des 60°C, l'agitation atomique devient telle que les liaisons les plus faibles, comme les liaisons hydrogène, se rompent. La protéine se déroule et devient une longue chaîne d'acides aminés : c'est la dénaturation.

  • Comment dénaturer une protéine ?

    On pourra utilement calculer : - Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350.

  • Comment calculer le taux de purification ?

    Précipitation à l'éthanol ou à l'acétone: On peut facilement précipiter les protéines en présence d'éthanol 80% (EtOH) en les gardant à -20°C quelques heures ou en amenant le mélange à ébullition durant quelques minutes. Une centrifugation permet alors de sédimenter les protéines précipitées.
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Purification des protéines recombinantes

Dr. MEDOUKALI

République Algérienne Démocratique et Populaire

Université Frères MentouriConstantine 1

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de Biochimie et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Biochimie Option Biochimie appliquée

Purification des protéines recombinantes

Pour suivre une purification,

1. Détermination de la concentration en protéine

deprotéines. interférences.

Purification des protéines recombinantes

1. Détermination de la concentration en protéine

LaspectrophotométrieUV

-Mesureà280nm. deuxacidesaminésdanslaprotéine. -Mesureà205nm. de. cuvettesdequartztrèspropres.

Purification des protéines recombinantes

1. Détermination de la concentration en protéine

La fluorimétrie

-On peut utiliser la fluorescence intrinsèque de la protéine en utilisant la fluorescence des tryptophanes avec

une excitation à 280 nm et une émission à 340 nm.

Purification des protéines recombinantes

1. Détermination de la concentration en protéine

Lesméthodescolorimétriques

-Lecuivre dede1mg/ml). protéineenbleu.

Lasensibilitéestdede100µg/ml.

Purification des protéines recombinantes

1. Détermination de la concentration en protéine

Lesméthodescolorimétriques

-Lescolorants (bleu). principalement,leurliaisonestpeuforte.

Purification des protéines recombinantes

1. Détermination de la concentration en protéine

Lesméthodescolorimétriques

mercapéthanol)

Purification des protéines recombinantes

2. Solubilisation des protéines

Extraction des protéines cellulaires

Pour aboutir à la purification d'une protéine, il faut tout d'abord préparer l'extrait qui contient cette protéine.

Si la protéine est intracellulaire, on doit passer par une étape de solubilisation : on casse les cellules et on

libère les protéines en solution. Pour casser les cellules, on a à notre disposition différentes méthodes : -choc osmotique

-lyse des parois par méthode enzymatique, on utilise par exemple le lysosymepour dissoudre la paroi des

bactéries Gram+. -homogénéiseurpotter. -choc par pression (French Press) -ultrasons -billes de verre (pour les levures)

Purification des protéines recombinantes

2. Solubilisation des protéines

Extraction des protéines cellulaires

Pour aboutir à la purification d'une protéine, il faut tout d'abord préparer l'extrait qui contient cette protéine.

Parfois les protéines sont membranaires et il est difficile de les solubiliser.

On peut alors utiliser un détergent qui, par interactions hydrophobes, va solubiliser la protéine.

Mais il faut faire attention car un détergeant trop fort peut inactiver la protéine Après séparation par ultrafiltration ou centrifugation, on obtient un extrait clarifié.

Purification des protéines recombinantes

2. Solubilisation des protéines

Extraction des protéines cellulaires

dessusde80C.

Purification des protéines recombinantes

2. Solubilisation des protéines

filtrationsurfiltrede0,45µm.

Purification des protéines recombinantes

2. Solubilisation des protéines

3. difficilevoirimpossible.

Purification des protéines recombinantes

3. La concentration des protéines

Par précipitation

ionique(saltingout). lesmoléculesd'eau. estsuffisante,ilyaprécipitation.

Purification des protéines recombinantes

3. La concentration des protéines

Par précipitation

solubilitédansl'eauà20C).

Purification des protéines recombinantes

3. La concentration des protéines

Par filtration

Purification des protéines recombinantes

3. La concentration des protéines

Par filtration

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

On peut utiliser deux grands types de méthodes pour séparer les protéines, la chromatographie Certaines méthodes seront utilisées pour purifier vérifier la pureté de la solution.

Purification des protéines recombinantes

La chromatographie

4. La séparation des protéines

La chromatographie est une technique de séparation qui utilise une colonne contenant un support

qui possède plusieurs propriétés (Il existe différents types de supports : cellulose, sephadex.).

Ondistingueplusieursétapes

2.Chargedelasolutionprotéique

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utiliséestungelacrylamide. initialiséeetonobtientunpolymère. concentrationdel'acrylamide. enacrylamideet bisacrylamidededépart.

4. La séparation des protéines

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Dialyse

dépourvudesels. plusimportants(30,50ou100kDa).

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Filtrationsurgel

changerletampon.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Ultrafiltration

moléculairesde1à100kDa. taille.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Ultracentrifugation

analytique.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

SipH

SipH>pI,lamoléculeestnégative.

Onutiliselachromatographie.

support.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

desgroupementsionisables. prochesenséquenced'acidesaminés.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

fonctiondeleurtailleetdeleurcharge.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

interagiraveclesprotéineshydrophobes. ((NH4)2SO4à1M). quisolubiliselesinteractionshydrophobes.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Siteactif

l'onchercheàpurifier. -Exempledechromatographieavecdestag:

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Modificationposttraductionnelle

fixéesurunecolonne. sucredanslaphasemobile.

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Séquenceprimaire

pluspopulaire. pourleNickelcequirendplusspécifique

Purification des protéines recombinantes

4. La séparation des protéines

Séparation selon la taille

Séparation selon la charge

Séparation selon la taille et la charge

Séparation par des colorants

Elles ressemblent à une chromatographie d'affinité mais sont moins spécifiques.

Bleu de cybacron

purifier les protéines ayant un site de reconnaissance du NAD. Comme de nombreuses protéines sont retenues par le bleu de cybacron purifier un grand nombre de protéines. L'élution s'effectue grâce à un gradient de sels.

Purification des protéines recombinantes

5. Evaluation de la pureté

observée/concentrationenprotéine.

Purification des protéines recombinantes

5. Evaluation de la pureté

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