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Purification des protéines

La purification d'une protéine est un processus qui prend plusieurs étapes: extraction initiale, précipitation

différentielle, dialyse, chromatographies de divers types, etc

Principales étapes d'une purification

Typiquement, on broie tout d'abord le matériel d'où on veut extraire la protéine (tissu animal, partie de plantes,

bactéries, etc). Divers appareils ("Waring Blender", appareil Potter-Eveljhem, "Polytron", etc.) peuvent être

employés à cette fin. Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée. Cette étape est

évidemment la première.

L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses

particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si

la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton,

Tween, etc., quelquefois déoxycholate) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment.

L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui

libèrent des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou

autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec des

protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Certains tissus comme le pancréas et de foie sont

reconnus pour contenir de grandes quantités de ces enzymes, ce qui pose tout un défi quand on travaille avec

ces tissus. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui

sont soit physiologiques (inhibiteur de trypsine, antipaïne. leupeptine...) ou artificiels (E64, PMSF...). Pour

maximiser leur action, on les emploie souvent en mélange ("cocktails") à large spectre d'action.

Ensuite on utilise diverses techniques pour séparer la protéine recherchée de toutes les autres présentes.

Habituellement les premières étapes sont des techniques peu spécifiques mais bien adaptées à la manipulation

de gros volumes. Ensuite, au fur et à mesure des étapes, on utilise des techniques de plus en plus spécifiques qui

sont souvent applicables à des préparations de volume réduit.

Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate

d'ammonium. C'est pourquoi on l'utilise très souvent immédiatement après l'homogénéisation pour se

débarrasser du gros des contaminants.

Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d`affinité, applicables à de bons volumes

d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires.

En finale, on utilise souvent le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation qui permettent de raffiner la pureté,

mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées.

Souvent, entre ces étapes, il faut éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. On utilise

alors une dialyse ou une ultrafiltration. Si on a besoin de concentrer la préparation, on la lyophilise. Si on veut

éviter ces procédures, on doit choisir des méthodes qui ne sont pas affectées négativement par ces produits.

Dosage des protéines et dosage de l'activité des protéines

Toutes ces étapes doivent être suivies de près pour vérifier si les techniques fonctionnent bien. Pour cela, il est

très courant de doser la protéine à purifier après chaque étape. Il faut donc posséder une méthode de dosage

(enzymatique, immunologique, biologique, etc.) pour suivre le processus. On mesure aussi la quantité totale de

protéines. Cette dernière valeur servira à calculer l'activité spécifique (voir tableau de purification)

Dans le cas où il s'agit de la première fois que la protéine est isolée, il faudra développer la méthode de dosage

avant même de développer la méthode de purification. Tableau de purification et critères de pureté

Durant toutes ces étapes, il est essentiel d'évaluer les deux facteurs clef, pureté et rendement. Le rendement (la

quantité de protéine obtenue) peut facilement être mesuré par dosage enzymatique, RIA, etc. Un tableau de

purification (voir section "calculs") est aussi un outil très utile à cette fin. Si on s'aperçoit qu'une des étapes de

purification provoque une perte substantielle d'activité ou de quantité de la protéine, on doit remettre en

question son utilité ou la qualité de son exécution. L'activité spécifique est une mesure quantitative de la pureté

de la préparation. Encore ici, si on s'aperçoit qu'une étape ne permet pas l'augmentation de la pureté, il faut

alors s'interroger sur sa pertinence. Pour être en mesure de calculer le rendement et la purification, il ne faut pas

oublier de mesurer le volume total de la fraction obtenue après chaque étape et d'en prélever des échantillons

qui permettront de doser les protéines totales et la quantité de la protéine qu'on cherche à isoler.

La pureté d'une préparation de protéine peut aussi être évaluée selon des critères qualitatifs. Ainsi elle peut être

facilement visualisée qualitativement par électrophorèse à haute résolution ou focalisation isoélectrique. Si on

n'aperçoit qu'une seule bande protéique, on peut conclure que la préparation ne contient qu'une protéine. Cette

évaluation qualitative peut cependant être faussée si la protéine est contaminée par une ou plusieurs autres de

même mobilité dans les conditions d'électrophorèse ou de focalisation. Ces techniques permettent aussi de

suivre la purification et de voir si le nombre de protéines contaminantes diminue au fur et à mesure du

processus pour finir, idéalement, par une seule espèce protéique.

MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc

utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique,

osmolarité, sels, antioxydants, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques",

comme le PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Ainsi, le salin (NaCl 150 mM ou 0.85

%) a une osmolarité presque physiologique de 300 mOs. On utilise souvent un tampon destiné à maintenir le

pH (généralement aux alentours de 7.4). Le PBS ("phosphate buffered saline") contient un tampon phosphate

pH 7.4 et l'osmolarité de la somme de toutes ses composantes est de 315 mOs. Les millieux physiologiques sont

discutés dans la section "solutions physiologiques" du SIITUB.

Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Le

phosphate (en mélange mono- et dibasique) est utilisé dans le PBS. Le Tris (trishydroxy-méthyl-

aminométhane) est très fréquemment utilisé en raison de son coût peu élevé, même s'il est peu efficace à pH 7.4

et inhibe certaines réactions physiologiques. L'hepes (hydroxyéthyl-pipérazine-éthane-sulfate) est aussi souvent

employé. Les qualités et défauts des principaux produits utilisés pour tamponner le pH dans les solutions

physiologiques sont discutés dans la section "pH métrie" du SIITUB.

Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une

dénaturation et favorise l'oxydation. C'est particulièrement le cas de l'oxydation de la fonction thiol des

cystéines en cystines, i.e. formation d'un lien disulfure. Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement

sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal leur

solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. L'emploi d'agents antioxydants comme le ß-mercapto-

éthanol ou un des réactifs de Cleland, dithiothréitol ou dithiothréitréol, est souvent recommandé pour protéger

ces protéines. Les protéines des compartiments extracellulaires (sang, liquide céphalo-rachidien, etc.) sont

beaucoup moins susceptibles à ce problème car ce sont des milieux légèrement oxydants. Les protéines de ces

compartiments ne contiennent pas ou très peu de thiols libres mais plutôt des liens disulfures.

Quand on travaille avec des protéines en quantités très faibles, il est important d'éviter de contaminer la

préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation

même, par exemple dans les lysosomes qui sont brisés lors du broyage des cellules ou par la présence de

détergents. Il y a également des sources exogènes, venant de l'extérieur, comme les mains, la salive, etc.

Conservation et rangement des protéines

Les protéines purifiées sont souvent peu stables et doivent généralement être conservées dans des conditions les

protégeant de la dégradation. La conservation à basse température est de rigueur. Certaines protéines sont

beaucoup plus exigeantes que d'autres et doivent être gardées à -80°C, cependant beaucoup se conservent aux

alentours de -20°C. Si les protéines sont stables sous forme sèche (en poudre), c'est la meilleure façon de les

conserver. Il est possible aussi de garder des protéines qui se dénaturent durant la congélation dans une solution

de glycérol. Cette méthode a l'avantage que le glycérol ne dénature pratiquement jamais les protéines et ne gèle

pas aux températures de l'ordre de -20°C. Certaines enzymes peuvent aussi être conservées dans une suspension

de cristaux de sulfate d'ammonium. Ces cristaux semblent stabiliser certaines protéines. Il convient aussi

d'éviter de répéter des cycles de congélation et de décongélation. La façon la plus commune d'éviter ce

problème est de congeler la préparation en petites fractions qui pourront être décongelées une à la fois. Le

rangement dans des solutions de glycérol ou des suspensions de sulfate d'ammonium permet aussi d'éviter ce

problème puisqu'elles restent liquides à -20°C; mais il faudra probablement se débarrasser de ce glycérol ou de

ce sulfate d'ammonium pour travailler avec ces protéines

Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc

utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique,

osmolarité, antioxydant, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques", comme le

PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on

inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les

exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une dénaturation et favorise l'oxydation, particulièrement

des cystéines en cystine (i.e. formation d'un lien disulfure). Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement

sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal une

solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. Une oxydation peut non seulement inactiver ou dénaturer

les protéines, mais aussi causer leur agrégation si la cystéine d'une protéine forme un lien disulfure avec celle

d'une autre protéine. L'emploi d'agents antioxydant comme le ß-mercapto-éthanol ou un des réactifs de Cleland

(dithiothréitol ou dithiotréitréol) est recommandé pour protéger ces protéines particulièrement sensibles. Ces

deux derniers remplacent de plus en plus souvent le ß-mercapto-éthanol, car ils sont beaucoup moins

"odorants".

La présence d'EDTA, pour chelater les ions métalliques, peut être utile car ces derniers accélèrent les réactions

d'oxydation des protéines. Le travail à basse température,"sur glace", ralentit aussi les processus de

dénaturation. Les opérations d'homogénéisation mécanique et de centrifugation sont particulièrement à

surveiller, car elles causent souvent une surchauffe de l'extrait.

Quand on isole ou on travaille avec de faibles quantités de protéines, il est important d'éviter de contaminer la

préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation

même, par exemple dans les lysosomes} qui sont brisés lors du broyage des cellules. Certains tissus comme le

pancréas en contiennent de grandes quantités. Elles peuvent aussi être exogènes, provenant de l'extérieur,

comme les mains, la salive, etc. Il existe de nombreuses préparations commerciales d'inhibiteurs ayant des

spécificités diverses par rapport au type de protéase. Ces inhibiteurs peuvent être des produits chimiques

simples comme l'EDTA qui bloque les métalloprotéases. On retrouve aussi des produits chimiques spécialisés,

comme le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) qui inhibe les protéases à sérine. Des inhibiteurs

biologiques sont aussi employés, comme la pepstatine, la a2-macroglobuline, etc. On peut même se procurer des

mélanges contenant un "cocktail" de divers inhibiteurs.

CALCULS

Tableau de purification

On exprime la pureté d'une préparation de protéines en parlant de son activité spécifique. L'activité est la

quantité de la protéine exprimée non pas en termes de poids mais de capacité catalytique ou biologique.

L'activité spécifique est l'activité par rapport à la quantité totale de l'ensemble des protéines dans la préparation.

Elle est généralement exprimée en unités (enzymatique ou autre) par poids de protéines totales (e.g. 12.34

U/mg de protéines). Plus l'activité spécifique est élevée, plus la protéine est pure. Il est fréquent d'obtenir des

facteurs de purifications de l'ordre de 5000 fois et des rendements de l'ordre de 5%.

La concentration des protéines totales est généralement obtenue en dosant les protéines totales d'échantillons

récoltés lors des différentes fractions obtenues lors de la purification. On fait de même pour la protéine

spécifiquement isolée: on mesure la quantité de cette protéine, pas dosage enzymatique s'il s'agit d'une enzyme.

Si la protéine n'a aucune activité enzymatique, on peut recourir à des bio-dosages, des Eliza, RIA, etc. Pour

connaitre la quantité totale de protéines (totales ou d'intérêt) il faut également connaitre le volume de la fraction

en question: [protéines dans la fraction] * volume de fraction (par exemple mg/mL * mL).

Il est courant de résumer les étapes de purification des protéines par un tableau de purification. Un tableau de

purification a l'allure suivante:

Ce tableau sert à montrer le rôle et l'efficacité de chaque étape dans le processus de purification. Il fait appel à

des notions et à des termes précis. Le facteur de purification est le nombre de fois qu'on a pu concentrer

l'activité spécifique (par rapport à la première étape) durant chacune des autres étapes de la procédure.

Normalement cette valeur est de plus en plus élevée au fur et à mesure des étapes. En effet la purification a

justement pour but d'obtenir une protéine de plus en plus pure, ayant donc une préparation dont l'activité

spécifique de plus en plus élevée. Le rendement de la purification est la proportion, en %, de la quantité de la

protéine purifiée qui reste par rapport à la quantité initiale. Le rendement diminue à chaque étape puisqu'il est

inévitable qu'on ait des pertes de matériel à chacune. Une purification est donc un "compromis" entre le désir

d'obtenir une protéine la plus pure possible (facteur de purification élevé) en quantité maximale (rendement

élevé). En effet, chaque étape supplémentaire, qui permet d'augmenter la pureté, cause des pertes de matériel,

donc diminue le rendement. Au cours d'une purification typique le facteur de purification augmente au fur et à

mesure des étapes tandis que, parallèlement, le rendement diminue.

Étape Protéines

totales (mg)

Activité

totale (U)

Activité spécifique

(U/mg protéines)

Facteur de

purification

Rendement

Homogénat initial 600 6000 10.0 1 100

Surnageant 150 3750 25.0 2.5 63

Fraction 20-50% sat. (NH4)2SO4 40 2500 62.5 6.3 42

Chromatographie d'échange

ionique 8 2000 250.0 25.0 33

Pour construire un tel tableau, on dose à chaque étape de purification la quantité de protéines totales et l'activité

volumique de la protéine en question. Généralement il s'agit d'une enzyme et son activité est exprimée en unités

enzymatiques. D'autres unités peuvent servir à définir des protéines sans activité enzymatique. Sachant le

volume de chaque fraction, la concentration des protéines totales et l'activité volumique, il devient facile de

construire le tableau de purification.

On peut obtenir les valeurs du tableau précédent avec les données suivantes. Pour chacune des fractions qu'on a

obtenues lors de la purification, on a mesuré le volume et prélevé des aliquotes pour doser les protéines totales

et l'activité de la protéine qu'on voulait isoler. Par exemple, l'homogénat du tableau a un volume de 150 mL et

contient 4 mg de protéines/mL et 40 U d'enzyme/mL. Cela permet d'obtenir la quantité de protéines totale (150

mL x 4 mg/mL = 600 mg de protéines totales), l'activité totale (40 U/mL x 150 mL = 6000 U) et l'activité

spécifique (6000 U ÷ 600 mg = 10 U/mg). De la même façon on obtient les valeurs des autres fractions. La

purification et le rendement se déduisent ensuite facilement. Ainsi pour le surnageant, on peut calculer la

purification (25 U/mg ÷ 10 U/mg = 2.5X) et le rendement (3750 U ÷ 6000 U = 62.5%).

Les étapes de purification vont faire appel à des techniques chromatographiques : (bio) affinité (AC),

échange d'ions (IEXC), interaction hydrophobe (HIC), exclusion-diffusion = gel filtration (GFC). La lecture

de ce paragraphe implique des connaissances de base concernant ces différentes chromatographies. Elles sont

détaillées dans des paragraphes dédiés.

1. Stratégie idéale de purification

1.1 Description générale

Dans l'idéal, il s'agirait de pratiquer une chromatographie avec une phase stationnaire et des conditions de

phase mobile qui retiendraient la seule protéine d'intérêt avec élution de toutes les autres protéines. Il suffit

de déclencher, dans un 2° temps, la sortie de la protéine d'intérêt. Pour cela, les chromatographies d'affinité

biospécifiques (AC) sont presque parfaites (pas tout à fait malheureusement, voir la suite ...).

Les étiquettes de type poly-histidinyls (his6) ou GST ajoutées en Nt ou Ct des protéines à purifier (on parle de

protéines de fusion) grâce aux technologies génétiques permettent de mettre en de façon très

systématique cette "stratégie idéale". A défaut d'étiquette, la "stratégie idéale" est possible si on peut mettre en

une chromatographie d'affinité traditionnelle avec un ligand judicieux à conjuguer au support de

chromatographie (voir le paragraphe dédié AC).

1.2 Exemples d'étiquettes de purification

Étiquette (Tag) Motif de liaison spécifique

Méthode d'élution de

la POI étiquetée retenue

His6-étiquette (parfois jusqu'à His10)

La plus célèbre des étiquettes de purification. Petite étiquette placée en Nt ou Ct qui ne perturbe généralement quasiment pas les repliements natifs ...Utilisable pour purification de protéines non natives en corps d'inclusions. Voir paragraphe dédié complémentaire ci-après. On utilise l'acronyme IMAC, Ion Metal Affinity

Chromatography.

Ni2+ chélaté (ou Cu2+)

Compétiteur

imidazole (250-500 mM) ou abaissement du pH vers ~pH 5 Glutathione S-transferase (GST). Étiquette de nature protéique à 220 aminoacides ! C'est gros.

Glutathion immobilisé

(GSH)

Glutathion (réduit)

(10-20 mM)

Maltose-binding protein (MBP). Une grosse

protéine, donc une très grosse étiquette. Amylose

Compétiteur maltose

(10 mM). C'est pas cher !

Strep-tag () / StrepII-tag

Petite étiquette assez inerte pour les repliements natifs de la protéine d'intérêt. se comporte comme de la biotine pour l'avidine.

Strep-TactinTM (comme si

de la streptavidine était immobilisée sur support pour retenir de la biotine (le

Strep-tag)

Compétiteur

Desthiobiotin (2.5

mM) puis régénération du support à la compétition HABA

1.3 Raffinage (polishing)

Souvent (tout dépend de l'état de pureté que l'on veut atteindre), la purification par bioaffinité devra être

suivie d'un raffinage (polishing). C'est par exemple le cas si on souhaite une protéine très pure après une

étape de type affinité IMAC (l'IMAC utilise l'étiquette 6-hitidinyls et la chélation sur support Ni2+ chélaté

...voir le paragraphe dédié) qui ne conduit pas à des puretés parfaites (voir paragraphe dédié).

Pour le raffinage, on met classiquement en une chromatographie d'échange d'ions (IEXC, élution en

gradient de force ionique) puis une exclusion-diffusion (GFC, gel filtration). La gel filtration est très

intéressante pour séparer différentes formes oligomériques par exemple.

2. Stratégie pas par pas sans bioaffinité

Il est très classique de débuter par une étape de précipitation fractionnée, souvent au sulfate d'ammonium

(pas forcément, voir le chapitre dédié) qui peut présenter l'avantage de concentrer l'échantillon protéique à

purifier. Si on souhaite purifier par une IEXC à la suite, il faudra éliminer le sulfate d'ammonium. Ce ne sera

pas le cas si on souhaite mettre en une HIC.

A propos des chromatographies d'affinité

1. Description générale

2. Les supports de phase stationnaire et la conjugaison du ligand de capture au support

2.1 Principes

2.2 Exemple 1

Voici un exemple de "chimie historique et classique au bromure de cyanogène" permettant d'activer et de

fixer un ligand (petite molécule ou protéine) présentant une fonction amine à un support agarose

Après conjugaison du ligand choisi (qui doit porter une fonction amine accessible), les sites activés ayant non

réagi seront éteints avec un réactif type éthanolamine.

2.3 Exemple 2

Exemple avec un support polyacrylamide (qui porte donc au départ des fonctions amides en surface),

activation, greffage d'un bras espaceur, activation et greffage d'un ligand à fonction amine.

2.4 Exemple 3

Exemple avec un support polyacrylamide (qui portait donc au départ des fonctions amides en surface)

commercialisé déjà activé et utilisable pour conjuguer des ligands à fonction amine.

Après conjugaison du ligand choisi (qui doit porter une fonction amine accessible), les sites activés ayant non

réagi seront éteints avec un réactif type éthanolamine.

3. Quelques exemples de phases stationnaires pour AC

3.1 Supports à ligand fixé prêts à l'emploi

On a vu au paragraphe 1 les supports classiques prêts à l'emploi pour purifier les protéines recombinées

étiquetées. On retiendra les chromatographies IMAC pour les protéines à étiquette 6-his et les supports à

glutathion immobilisé pour les protéines à étiquette GST.

Les supports prêts à l'emploi à protéine A ou à protéine G greffée (2 protéines à affinité pour le fragment Fc

des IgG) sont commercialisés par de nombreux fabricants. Les supports à bleu cibacron greffé sont aussi

commercialisés par de nombreux fabricants. Le bleu cibacron fixe de façon très affine la sérumalbumine

(chromatographie de nettoyage de l'albumine dans les purifications d'igG) et présente une affinité pour les

motifs nucléotidiques ce qui permet son utilisation pour la purification de déhydrogénases à NAD+ aou

autres enzymes...

3.2 Supports activés pour conjuguer le ligand de son choix

On l'a vu ci-dessus sur 2 exemples, la plupart des supports activés sont des supports réactifs aux fonctions

amines. Mais on en trouve des réactifs aux fonctions -SH ou aux fonctions aldéhydes. La réactivité aux

fonctions aldéhydes est intéressante puisqu'il est facile de faire apparaître de telles fonctions sur les motifs

oses des glycoprotéines par oxydation au périodate.

4. Elutions en AC

Pour éluer les protéines retenues (donc la protéine d'intérêt), il y a 2 grandes méthodes en AC :

l'élution compétition ; l'élution par modification des conditions physico-chimiques de milieu.

4.1 Elutions compétitions

Elles sont de 2 types selon les 2 schémas ci-dessous.

Par exemple, en IMAC, c'est le deuxième type de compétition qui est très souvent utilisé pour éluer la POI

étiquetée 6-his retenue. On va éluer grâce au compétiteur imidazole à concentration élevée qui va chélater le

Ni2+ du support et déplacer la POI. La POI sera éluée en présence de l'imidazole (en excès). Une dialyse ou

un dessalage par gel filtration ou par diafiltration permettront d'éliminer l'imidazole de la préparation de POI.

Le support IMAC devra être rééquilibré par un tampon sans imidazole pour en chasser peu à peu l'imidazole

chélaté (de l'eau prendra sa place).

4.2 Elution par modification des conditions physico-chimiques de milieu

Par exemple, en IMAC, si on abaisse le pH vers 5, on va protoner les N des noyaux imidazoles des histidines

(perte de disponibilité du doublet libre de chélation avec Ni2+ du support) et la POI se décroche. Encore faut-

il qu'elle supporte pH vers 5... A propos de la chromatographie IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography)

Ni2+ (ou Co2+) peut former des complexes avec 4 ou 6 liaisons. On peut l'immobiliser sur des phases

stationnaires greffées de motifs chimiques qui pourront le lier avec 4 coordinences et telles que Ni2+ (ou

Co2+) ainsi immobilisé puisse réaliser ses 2 dernières liaisons de coordinence avec une étiquette his-6 ajoutée

à une protéine à purifier. Les 2 figures ci-dessous présentent une résine " classique » nickel-NTA(nickel-

nitrilotriacetic acid). Le motif acide nitriloacétique greffé forme un chelate tétradentate avec Ni2+. Il reste 2

coordinences pour interagir avec les atomes d'azote du cycle de la chaîne latérale de deux résidus histidines.

Certains appellent l'IMAC chromatographie d'affinité cation métallique-chélate, c'est une meilleure

appellation que chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (Immobilized Metal Affinity Chromatography) mais cette dénomination est peu fréquente

" A possible model is that of an interaction of a metal ion with histidine residues n and n+2 of a His tag. This

is confirmed by the fact that IMAC ligands can bind to His tags consisting of consecutive histidine residues

as well as to alternating tags. As at least consecutive His tags are usually unstructured and thus flexible, other

interaction patterns such as n:n+1, n:n+3, n:n+4, and so on could be imagined as well... » D'après Helena

Block et al. ; Methods in Enzymology, 2009 ; Volume 463, 439:473.

À pH <6 les résidus histidines vont se protoner (le doublet libre de N devient ainsi indisponible pour établir

une liaison de coordinence avec Ni2+) et ne pourront plus lier le nickel. On pourrait donc utiliser une

l'imidazole.

La sélectivité pour l'étiquette his-6 n'est pas parfaite. " In E.coli, the proteins observed to copurify with His-

tagged target proteins can be divided into four groups: (i) proteins with natural metal-binding motifs, (ii)

proteins with histidine clusters on their surfaces ... » (Pour de telles protéines, une colonne Ni-NTA peut

servir de colonne d'affinité même sans l'ajout d'une étiquette...) Les élutions en mode gradient sont recommandées.

Le nickel peut être chélaté par l'EDTA ou l'EGTA, aussi ces composés doivent être utilisés avec parcimonie.

A propos des chromatographies de gel filtration (exclusion-diffusion, exclusion de taille) (GF) Un schéma adapté de http://www.bbioo.com/uploadfile/200806/2008060221240272.jpg

Les gel filtrations sont très utilisées comme dernière étape de purification (polissage), elles permettent

notamment de séparer les formations oligomériques non désirées comme le montre l'exemple ci-dessous tiré

de la documentation technique GE healthcare.

Les protéines sont des molécules sensibles à leur environnment et peuvent être facilement dénaturées. C'est à

dire que leur structure peut être modifiée jusqu'au point où elles perdent temporairement ou définivement leurs

propriétés biologiques.

D'autre part, il arrive fréquemment qu'on veuille séparer les protéines d'une solution, soit pour se débarrasser

des protéines et ne garder que les petites molécules de solution, soit au contraire pour se débarrasser des petites

molécules. On peut aussi vouloir se débarasser d'une partie des protéines. Une des façons les plus rapides est

évidemment de les précipiter. La précipitation peut aussi être contrôlée de façon à ne toucher que certaines

d`entre elles, par précipitation différentielle, ce qui permet de les séparer dans des procédures d'isolement.

Très souvent la dénaturation cause la perte de solublité des protéines. C'est pourquoi nous verrons ces deux

phénomènes ensemble

PRINCIPES DE BASE

Un changement des conditions environnement les protéines leur fait souvent perdre leur propriétés biologiques

et même physique.

Donc, la solubilité des protéines dans une solution aqueuse dépend, entre autres, des conditions ioniques et de

pH. Trois phénomènes de base agissent pour affecter la solubilité des protéines en solution aqueuse:

l'hydratation, la charge électrostatique et la leur conformation. Ces explications valent évidemment pour les

protéines hydroslubles et non pas pour les protéines hydrophobes des membranes. Très souvent ils se

conjuguent ensemble et la précipitation résulte de plusieurs phénomènes additifs.

Chaque protéine a évidemment des caractéristiques particulières à ce niveau. Le comportement général de

toutes les protéines est cependant le même.

Les protéines, sauf celles intégrées dans les membranes cellulaire, sont d'autant plus solubles en solution

aqueuse qu'elles sont hydratées. Cette coque d'hydratation les empêche de s'aggréger ensemble. Une trop

grande agrégation les fait précipiter puisque la solvatation de ces agrégats est proportionnellement moins

grande que celle des protéines individuelles. En ajoutant des produits déshydratants qui compétitionnent avec

les protéines pour l'eau d'hydratation, on peut donc provoquer la précipitation des protéines. Des produits

comme le polyéthylène glycol agissent de cette façon.

Se superposant à ce phénomène, les conditions ioniques d'une solution affectent aussi la solubilité des

protéines. En effet, si les protéines sont électriquement chargées de la même façon, elles auront tendance à se

repousser, donc à ne pas s'aggréger. Au contraire, si elles sont électriquement neutres, cette répulsion disparaît,

et l'agrégation devient possible. On peut utiliser ce phénomène soit en jouant sur le pH de la solution ou avec

des électrolytes. Les électrolytes employés ici sont des sels très solubles en milieu aqueux Les cations peuvent

neutraliser les charges négatives des chaînes latérales des acides aminés et les anions neutralisent les charges

positives. Ces protéines neutralisées ne se repousseront plus, elles pourront s'agréger en complexes de solubilité

substantiellement réduite pouvant facilement précipiter. Au point isoélectrique les protéines sont également

neutres. En amenant le pH au pI de certaines protéines, on peut donc aussi précipiter celles-ci. Dans les deux

cas, pH ou électrolytes, les protéines ne précipiteront pas toutes en même temps puisque leur pI ou le nombre et

la nature de leurs charges ne sont pas identiques. La plupart des électrolytes combinent à la fois la

déshydratation et la neutralisation des protéines.

Un troisième phénomène peut aussi entrer en jeu, la structure des protéines et leur dénaturation. A leur état natif

les protéines les groupes latéraux des acides aminés qui les composent leur permettent d'être solubles en milieu

aqueux. En effet les chaines latérales chargées (glu, asp, lys, arg. etc.) ou faciles à hydrater ou formant des

ponts hydrogène avec l'eau (ser, thr, etc.) sont souvent dirigés vers l'extérieur de la molécule maximisant leur

contact avec le milieu aqueux. Au contraire, les acides possédant des chaines latérales hydrophobes (phe, trp,

tyr) sont généralement camouflés à l'intérieur, minimisant ces contacts. La dénaturation brise cette organisation

et ramène à la surface des groupements hydrophobes qui vont avoir tendance à s'agréger entre eux et avec les

groupements hydrophobes des autres protéines dénaturées. Non seulement les protéines dénaturées sont

agrégées, mais leurs groupements hydrophobes sont plus exposés au milieu aqueux, diminuant encore plus leur

solubilité. Les solvants organiques (acétone, phénol), les acides forts peu concentrés ou des températures

élevées sont souvent utilisés à cette fin

MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

Précipitation totale

Comme son nom l'indique les méthodes de précipitation totale des protéines visent à éliminer l'ensemble des

protéines d'une solution. ce résultat s'obtient par des conditions plutôt draconiennes qui, le plus souvent,

dénaturent irréversiblement les protéines. La précipitation totale est utilisée quand on veut séparer les protéines

des autres petites molécules contaminantes, acides aminés, sucres, etc.., ou, quelquefois, des autres

macromolécules. Cette approche est donc incompatible à des procédures ou on veut récupérer une protéine

intacte et fonctionnelle. Suivent certaines techniques de dénaturation totale.

Précipitation à l'éthanol ou à l'acétone: On peut facilement précipiter les protéines en présence d'éthanol 80%

(EtOH) en les gardant à -20°C quelques heures ou en amenant le mélange à ébullition durant quelques minutes.

Une centrifugation permet alors de sédimenter les protéines précipitées. L'éthanol résiduel peut être enlevé par

extraction des protéines resuspendues en milieu aqueux avec du chloroforme. Le principal inconvénient de cette

méthode est le grand volume d'EtOH qu'on doit utiliser, au moins quatre fois celui de la solution protéique

aqueuse. Il faut souligner en plus que la précipitation n'est pas complète, car certaines protéines sont plus ou

moins solubles dans l'éthanol. Une variante plus efficace utilise de l'acétone au lieu de l'EtOH. Deux fois le

volume de solution protéique est suffisant. La précipitation à l'acétone est aussi plus efficace car, contrairement

à l'éthanol, très peu de protéines sont solubles dans l'acétone. Cependant la préparation de protéines résultante

est très difficile à redissoudre.

Précipitation au phénol: Une méthode a été développée spécifiquement pour extraire des petites quantités de

protéines avec du phénol. Les protéines se dénaturent et beaucoup deviennent solubles dans le phénol ou

s'agglomèrent à l'interface phénol-eau, contrairement aux petites molécules et aux acides nucléiques qui restent

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