[PDF] Chapitre 5. Spectrométrie de masse pour lanalyse des protéines

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1 FOMSLPUH DB 6SHŃPURPpPULH GH PMVVH SRXU O·MQMO\VH GHV SURPpLQHVB

Introduction et généralités J

1. La détection par spectrométrie de masse SM.

2. 6PUXŃPXUH G·XQ VSHŃPURPqPUH GH PMVVHB 60

3. Principe d'un spectromètre de masse.

4. Les différents composants du spectromètre de masse SM.

5. Utilisation

6. ([HPSOH G·XQ VSHŃPUH GH PMVVH

7. Exercices.

Introduction et généralités J

Les protéines constituent avec les polysaccharides et les acides nucléiques une TeV WroiV claVVeV Te biopolymèreV inWervenanW TanV la VWrucWure eW TanV le foncWionnemenW Te WouV leV organiVmeV vivanWV. I·hydrolyse totale TeV proWéineV conTuiW aux aciTeV aminéV qui leV caracWériVenW. Parmi leV aciTeV aminéV iVoléV Tu règne vivanWH une vingWaine VeulemenW VonW TeV conVPLPXMQPV GHV SURPpLQHV QMPLYHVB +XLP VRQP QpŃHVVMLUHV j O·HVSqŃH OXPMLQH ŃMU nos cellules ne peuvent les synthétiser (Leu, Thr, Lys H Trp H PUeH ValH ÓeWH IVl). IlV VRQP HVVHQPLHOV HP GRLYHQP rPUH SUpVHQPV GMQV O·MOLPHQPMPLRQ OHV GRX]H MXPUHV acides aminéV VonW VynWUéWiVéV TanV leV celluleV à parWir Te VubVWanceV pluV VimpleV conWenanW carboneH UyTrogèneH oxygèneH aYoWe eW Voufre.

1. La détection par spectrométrie de masse SM.

La VpecWroméWrie Te maVVe eVW une WecUnique pUyVique TGanalyVe permeWWanW Te TéWecWer eW TGiTenWifier TeV moléculeV G·LQPpUrP SMU PHVXUH GH OHXU PMVVH et de caracWériVer leur VWrucWure cUimique. Son principe réViTe TanV la VéparaWion en pUaVe gaYeuVe Te moléculeV cUargéeV (ionV) en foncWion Te leur rapporW maVVeIcUarge (m/z). Nlle eVW uWiliVée TanV praWiquemenW WouV leV TomaineV VcienWifiqueV J pUyViqueH aVWropUyViqueH cUimie en pUaVe gaYeuVeH cUimie organiqueH ToVageVH biologieH méTecine... le WempV Te TéWecWion eVW WrèV rapiTe. 2

IM VSHŃPURPpPULH GH PMVVH HVP G

MNRUG XQH PpPORGH G·MQMO\VH VSHŃPUMOH ŃMSMNOH de fournir la masse moléculaire et des renseignements VWrucWuraux Vur leV moléculeV.

2. 6PUXŃPXUH G·un VpecWromèWre Te maVVe. SÓ

Le VpecWromèWre Te maVVeH comporWe une Vource TGioniVaWion Vuivie TGun ou pluVieurV analyVeurV qui VéparenW leV ionV proTuiWV Velon leur rapporW m/z, d'un TéWecWeur qui compWe leV ionV eW amplifie le VignalH eW enfin TGun VyVWème informaWique pour WraiWer le Vignal. Le réVulWaW obWenu eVW un VpecWre Te maVVe repréVenWanW leV rapporWV m/z, où m repréVenWe la maVVe eW Y la valence (ou mIqH q repréVenWanW la cUarge) TeV ionV TéWecWéV Velon lGaxe TeV abVciVVeV eW lGabonTance relaWive Te ceV ionV Velon lGaxe

Te orTonnéeV.

IHV GLIIpUHQPV ŃRPSRVMQPV G·XQ VSHŃPURPqPUH GH PMVVHB 60B

3. Principe d'un spectromètre de masse.

Fondamentalement, un VpecWromèWre Te maVVe conWienW 5 parWieV J - HQPURGXŃPLRQ GH O·pŃOMQPLOORQ - une source de production d'ions, - un système analyseur des rapports masse sur charge (m/z),

Source d'ions

Analyseur(s)

Détecteur

Tension

Echantillon

Enregistrements (courants)

stockage et traitement des informations signal 3 - un TéWecWeurH - Un système de traitement, stockage de données (microinformatique) eVW aVVocié au VpecWromèWre pour gérer leV Vignaux réVulWanWV Te lGanalyVe eW impoVer un réWroconWrôle Te lGappareil.

4. LeV TifférenWV compoVanWV Tu VpecWromèWre Te maVVe SÓ.

Le système G·LQPURGXŃPLRQ de O·pŃOMQPLOORQ J O·pŃOMQPLOORQ SHXP rPUH LQPURGXLP

TirecWemenW TanV la VourceH VouV forme gaYeuVeH liquiTe (infuVion TirecWe) ou VoliTe ou encore par lGaVVociaWion à une méWUoTe VéparaWive (cUromaWograpUie en pUaVe liquiTeH cUromaWograpUie en pUaVe gaYeuVeH élecWropUorèVe capillaire...). La source d'ionisation J elle conViVWe à vaporiVer leV moléculeV eW à leV ioniVer. Une Vource TGioniVaWion peuW êWre uWiliVée VoiW en moTe poViWif pour éWuTier leV ionV poViWifVH VoiW en moTe négaWif pour éWuTier leV ionV négaWifV. Il exiVWe pluVieurV VRXUŃHV G·LRQLVMPLRQ QRXV QH ŃLPHURQV TXH quelques VRXUŃHV G·LRQLVMPLRQV. - L'ionisation électronique (EI), - l'ioniVaWion cUimique (CI) - Electrospray ionisation ESI ou L'élecWronébuliVaWion. I·MQMO\VHXU J il Vépare leV ionV en foncWion Te leur rapporW maVVeIcUarge (m/z). Il comporWe un VyVWème comprenanW un VecWeur magnéWique couplé à un VecWeur élecWrique qui permeW Te Werminer le WempV Te vol (TOŃ)H Te cUaque ion. CeV analyVeurV peuvenW êWre coupléV enWre eux pour réaliVer TeV expérienceV Te VpecWroméWrie Te maVVe en WanTem (ÓSIÓS). Nn généralH un premier analyVeur Vépare leV ionVH une cellule Te colliVion permeW Te fragmenWer leV ionVH eW un VeconT analyVeur Vépare leV ionV fragmenWV. CerWainV analyVeurVH comme leV piègeV à ionVH conVWiWuenW pluVieurV analyVeurV en un eW permeWWenW Te fragmenWer leV ionV eW TGanalyVer leV fragmenWV TirecWemenW. Le détecteur eW VyVWème Te WraiWemenW J le TéWecWeur WranVforme leV ionV en Vignal élecWrique. PluV leV ionV VonW nombreuxH pluV le couranW eVW imporWanW. Me pluVH le TéWecWeur amplifie le Vignal obWenu pour quGil puiVVe êWre WraiWé informaWiquemenW. 4

5. Utilisation

Un spectromètre de masse permet de réaliVer leV foncWionV VuivanWeV J Identification des molécules J un VpecWre Te maVVe peuW êWre caracWériVWique TGune molécule. AinVi en le comparanW avec le conWenu Te banqueV Te VpecWreVH il eVW poVVible TGiTenWifier la molécule. La VpecWroméWrie Te maVVe permeW Te meVurer avec préciVion la maVVe mono-iVoWopique TGun ion eW TGen TéTuire

Va formule bruWe.

Analyse structurale J LeV ionV moléculaireV peuvenW Ve fragmenWer TanV un VpecWromèWre Te maVVe J TanV la Vource TGioniVaWionH TanV lGanalyVeur ou TanV une cellule Te colliVion. Comme leV fragmenWaWionV reVpecWenW TeV loiV préciVeVH lGéWuTe Te ceV fragmenWV permeW Te TéWerminer la VWrucWure TeV moléculeV ioniVéeV. Quantification J Un VpecWromèWre Te maVVe poVVèTe un TéWecWeur WrèV VenVible permeWWanW Te faire une quanWificaWion fiable TeV moléculeV ioniVéeV. (MenViWé opWique ou InWenViWé relaWive).

La Vource TGioniVaWion

Les ionisations EI et CI, qui nécessitent un certain niveau de vide, sont préférenWiellemenW uWiliVéeV en couplage avec la cUromaWograpUie en pUaVe gaYeuVe (la CI foncWionnanW à parWir TGune Vource NI). Nn revancUeH leV Teux VourceV à preVVion aWmoVpUérique (elecWroVpray eW APCI) TiWeV à " ioniVaWion Touce »H VonW principalemenW uWiliVéeV en couplage avec la cUromaWograpUie en pUaVe liquiTe.

L'ioniVaWion élecWronique (NI)

Source d'ionisation électronique. MeV élecWronV émiV par un filamenW renconWrenW leV moléculeV qui enWrenW TanV la Vource J lorV Te la renconWreH Vi lGénergie cinéWique TeV élecWronV eVW VuffiVanWeH un élecWron eVW arracUé Te la molécule M, la WranVformanW en un ion raTical M+o. Celui-ci peuW enVuiWe Ve fragmenWer VuivanW Von énergie inWerne. LGNI conTuiW ainVi à un VpecWre aVVeY fourniH avec Te nombreux fragmenWVH WrèV ricUe en informaWionV VWrucWuraleV.

L'ionisation chimique (CI)

Source d'ionisation chimique. Nn pluV Tu TiVpoViWif NI ci-TeVVuVH un gaY réacWif eVW inWroTuiW TanV la Vource eW ioniVé par impacW élecWronique. SGenVuiW une Vérie Te réacWionV qui Tonne naiVVance à TeV ionV pouvanW réagir avec leV moléculeV 5 d'analyte arrivanW TanV la Vource. Ce Wype Te réacWionV ionV-moléculeV proTuiW principalemenW (en moTe poViWif) TeV ionV [ÓH]+, et [M+aTTuiW+H]+, permettant ainVi TGaccéTer à la maVVe moléculaire Te la molécule à analyVer. Le méWUaneH lGiVobuWane eW lGammoniac VonW parmi leV gaY TGioniVaWion cUimique leV pluV uWiliVéV. L'ionisation par bombardement d'atomes rapides (FAB). Elle permet d'analyser des molécules non vaporiVableV VouV viTe (groVVeV moléculeV biologiqueV). LGioniVaWion eVW effecWuée par expulVion en pUaVe vapeur TeV ionV conWenuV TanV un écUanWillon liquiTe à la VuiWe TGun bombarTemenW TGaWomeV rapiTeV (Ar ou Xe). LeV moléculeV ainVi ioniVéeV nGonW paV beaucoup TGénergie inWerneH la fragmenWaWion eVW Tonc faible maiV lGion moléculaire eVW facilemenW reconnaiVVable eW la maVVe moléculaire eVW facile à TéWerminer. Electrospray ionisation (NSI) ou élecWronébuliVaWion F·HVP XQH LRQLVMPLRQ GRXŃHB Son principe est le suivant J à preVVion aWmoVpUériqueH

leV gouWWeleWWeV Te VoluWéV VonW forméeV à lGexWrémiWé TGun fin capillaire porWé à

un poWenWiel élevé. SouV lGeffeW Tu cUamp élecWrique eW grâce à lGaVViVWance évenWuelle TGun couranW TGairH lGeffluenW liquiTe eVW WranVformé en nuage Te fineV gouWWeleWWeV (Vpray) cUargéeV VuivanW le moTe TGioniVaWion. MuranW ce parcourV à preVVion élevéeH leV ionV VubiVVenW Te mulWipleV colliVionV avec leV moléculeV Te gaY eW Te VolvanW. Nn faiVanW varier leV poWenWielV élecWriqueV appliquéV TanV la Vource il eVW poVVible Te provoquer TeV fragmenWaWionV pluV ou moinV imporWanWeV.

L'analyseur

Les analyseurs se différencient par leur principe de mesure du rapport m/z TeV ionV. - IlV permeWWenW la TiVperVion TeV ionVH grâce aux inVWrumenWV à VecWeur magnéWique ou élecWrique - IlV permeWWenW la VéparaWion TeV ionVH en foncWion Te la maVVe moléculaire eW le WempV Te vol ou Time Of ŃligUW (TOŃ) lié avec la viWeVVe Te vol. - IlV permeWWenW la WranVmiVVion TeV ionV WraverVanW un cUamp magnéWique ou

élecWroTynamique ;

6 L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, accéléré préalablemenW par une WenVionH à parcourir une TiVWance Tonnée. Le rapporW maVVe Vur cUarge eVW TirecWemenW meVurable à parWir Tu WempV Te vol.

LGanalyVeur à VecWeur magnéWique

6ŃOpPM GH OM VPUXŃPXUH G·XQ Vpectromètre de masse.

Le détecteur

Comme les analyseurs et les sources G·LRQLVMPLRQ, il existe différents types de TéWecWeurV. IlV VonW WouV baVéV Vur TeV principeV pUyViqueV TifférenWVH maiV leur rôle reVWe le mêmeH compWer leV ionV. LeV TéWecWeurV VonW TeV compWeurV eW amplificaWeurV Vignaux TeV ionVH ilV permeWWenW Te WranVformer un couranW ionique faible en un Vignal meVurable. IlV fouUQLVVHQP GHV LQIRUPMPLRQV VXU OH PHPSV G·MUULYMJH GHV LRQV MX GpPHŃPHXU HP OHXU intensité.

Le VyVWème informaWique J

F·HVP MX V\VPqPH LQIRUPMPLTXH TXL GpPHUPLQH OM PMVVH VXU ŃOMUJH m/z) en fonction GX PHPSV G·MUULYMJH MX GpPHŃPHXU HP OHV SMUMPqPUHV GH O·MQMO\VHXUB 7

6. ([HPSOH G·XQ VSHŃPUH GH PMVVH G·XQH SURPpLQH x.

HO IMXP G·MNRUG ŃRQQMLPUH OM PMVVH PROMLUH GH chaque élément du tableau des éléments périoTiqueV .Tableau Te ÓenTeliev La maVVe monoiVoWopiqueH la maVVe aWomiqueH maVVe GX UpVLGX G·acide aminé. LeV aciTeV aminéV VonW compoVéV eVVenWiellemenW Te J Carbone J C HyTrogène J H Oxygène J O AYoWe J N PUoVpUore J P Souffre J S. SoTium J Na+ PoWaVVium J O+ Ion Ammonium NH4+ A cUacun Te ceV élémenWV correVponT une maVVe aWomique. ConnaiVVanW la fRUPXOH NUXPH G·XQH PROécule, on peut donc calculer la maVVe cUimique.

3MU H[HPSOH O·MOMQLQH F+3F+F22+1+2 VRLP F3+7102

= (3x12H01115)+(7x1H00797)+(1x14H0067)+(2x15H9994) =89H09474 Ma I·XQLPp GH PMVVH X HVP MSSHOpH GMOPRQ GM SRXU XQH PMVVH ŃOLPLTXHB (OOH HVP GpILQLH ŃRPPH 1C12 GH OM PMVVH G·XQ MPRPH GH ŃMUNRQH 12

1u =1Ma = 1H660540x 10-27 kg

Spectre de masse en moTe poViWif Ó+H+ (Ó=482). - Le pic à mIY=505 (Ó+23) correVponT à lGion aTTuiW [Ó+Na]+. 505.0
500.0
421.0
391.0
M+Na 380
440
460
480
500
520
400
420
6 1.0 e 2.5 e 6 4.5 e 6 6.0 6 e 6 3.0 e 521.0
483.0
537.0
M+NH 4 M+H M+K 8 - La masse moléculaire est confirmée par la présence d'un adduit [M+K] + à mIY=521 (Ó+39) eW - Nn aciTifianW la VoluWion avec HCOOHH lGion [Ó+H]+ apparaîW Vur le VpecWre ainVi que lGion [Ó+NH4]+ En moTe poViWifH lGobWenWion Te lGion [Ó+H]+ par WranVferW TGun proWon Vur la molécule Te maVVe Ó Vera majoriWairemenW recUercUée. CeW ion eVW en effeW le pluV facile à inWerpréWer. TrèV VouvenW auVViH la préVence TGionV "aTTuiWV" peuW êWre obVervée avec leV caWionV Te méWaux alcalinV (Na+, K+ RX HQŃRUH MYHŃ O·LRQ MPPRQLXP 1+4+). 9

7. Exercices J

SWrucWure cUimique TeV AciTeV aminéV.

10 Tableau ² MénominaWionH coTe eW maVVe monoiVoWopique TeV aciTeV aminéV.

SoiW une proWéine J Ala-gly-leu.

Monner Von VpecWre Te maVVe poVVible.

Acide aminé

Code à

3 lettres

Code à

1 lettre Poids (en g/mol) alanine Ala A 89,1 arginine Arg R 174,2 asparagine Asn N 132,1 aspartate Asp D 133,1 cystéine Cys C 121,2 glutamate Glu E 147,1 glutamine Gln Q 146,2 glycine Gly G 75,1 histidine His H 155,2 isoleucine Ile I 131,2 leucine Leu L 131,2 lysine Lys K 146,2 méthionine Met M 149,2 phénylalanine Phe F 165,2 proline Pro P 115,1 sérine Ser S 105,1 thréonine Thr T 119,1 tryptophane Trp W 204,2 tyrosine Tyr Y 181,2 valine Val V 117,1 11quotesdbs_dbs15.pdfusesText_21

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