LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE DADN
Il faut alors indiquer qu'à cette étape certains plasmides sont refermés sans aucune molécule d'ADN étrangère. I. 1. 4. Transformation des cellules. Dans l'
5.le clonage.pdf
Cette étape d'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur repose sur l'utilisation d'outils et de techniques de biologie moléculaire permettant la
Génie Génétique
Le clonage moléculaire consiste à l'insertion d'une séquence d'ADN dénommé insert dans un vecteur approprié puis son COSMIDE: ETAPE D'EMCOMPAQUETAGE 1.
TD : clonage/ADN recombinant
Comment définir un schéma de clonage? Page 3. Couper: les enzymes de restriction. Page 4
GENIE GENETIQUE
Etapes de clonage et construction des Banques génomiques et d'ADN Techniques de criblage des clones d'intérêt par hybridation avec une sonde.
LE CLONAGE HUMAIN À BUT REPRODUCTIF Document présenté
9 juin 2003 FIGURE 1 : LES DIFFÉRENTES ÉTAPES DU CLONAGE PAR TRANSPLANTATION NUCLÉAIRE ... PDF/WHA51/ear10.pdf (page consultée le 1 mai 2003). OMS 1999.
Mise au point sur le clonage des gènes la préparation et lutilisation
Le clonage du fragment choisi est obtenu en faisant proliférer la cellule transformée suivant les Les étapes de la synthèse et du clonage de l'ADN.
3: Clonage dun gène dans un plasmide
Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique. Il consiste à insérer un fragment d'ADN (dénommé insert) dans un vecteur approprié comme un
Contribution à lidentification et au clonage du gène de résistance
11 sept. 2007 Lors d'une réaction incompatible la réaction de défense de la plante passe par trois phases. La première étape est la reconnaissance de l'agent ...
Production de Protéines Recombinantes
Étapes d'une production de protéine recombinante. D ifférentes étapes de la traduction procaryote . ... Vecteurs de clonage et l'analyse des vecteur .
[PDF] clonagepdf - Faculté des Sciences de Rabat
Un vecteur de clonage courant est le plasmide bactérien L'ADN du plasmide est coupé par une enzyme de restriction et lié in vitro au fragment d'ADN
[PDF] 5le clonagepdf - Méthodologie et termes techniques
Le clonage désigne principalement le processus de multiplication d'un organisme d'une cellule souche ou d'un gène en grand nombre d'exemplaires identiques
[PDF] LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE DADN
Les différentes étapes passent par : la construction d'une banque d'ADN I 1 Préparation d'une banque d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction : banque
[PDF] Génie Génétique - univ-ustodz
1 Vecteur de clonage : renferme une origine de réplication et permet de cloner un segment d'ADN ou un gène qui y est intégré
[PDF] TD : clonage/ADN recombinant - inra
Définition du clonage: Multiplication in vitro d'un organisme d'une cellule souche ou d'un gène en grand nombre d'exemplaires identiques
[PDF] AFR/RC55/14 Page 1 INTRODUCTION 1 Le mot clonage est un
17 jui 2005 · Un clone est un organisme qui est la copie génétique d'un organisme existant Le clonage peut s'opérer naturellement; par exemple des clones
[PDF] GENIE GENETIQUE - ISBST
Etapes de clonage et construction des Banques génomiques et d'ADN omplémentaires Planche 1 : carte de restriction du plasmide pBR322
[PDF] 3: Clonage dun gène dans un plasmide - BiOutils
Cette sélection bleu/blanc est un moyen très pratique de sélectionner les colonies qui contiennent le plasmide avec insert Page 2 PROTOCOLE 1) Digestion Les
[PDF] génie-génétique-polycopiepdf
1 Le principe du clonage 2 Les bases du clonage de l'ADN clonage peut être divisée en plusieurs étapes comme suit (Figure 13) (Winter et al 2000 ;
[PDF] Mise au point sur le clonage des gènes la préparation et lutilisation
1 DNA is cut using restriction enzymes and bound to another DNA fragment 1) Le procédé de clonage de gènes s'appuie sur quatre étapes biochimiques et
Quelles sont les différentes étapes du clonage ?
Étapes du clonage moléculaire
la digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction ; la ligation de l'ADN à un vecteur d'insertion ; la transformation de l'organisme hôte (comme une bactérie) avec le vecteur d'insertion ; la sélection et la vérification de la présence de la séquence d'ADN clonée.Comment sélectionner les clones recombinants ?
deux gènes de résistance, l'un à l'ampicilline, l'autre à la tétracycline peuvent servir de marqueurs pour sélectionner aisément les clones transformés par des plasmides recombinés.Quelles sont les caractéristiques d'un vecteur de clonage ?
PROPRIÉTÉS DES VECTEURS DE CLONAGE
Réplication autonome et indépendante de l'ADN de la cellule hôte. 2. Petite taille: pour permettre l'insertion de grand fragment d'ADN étranger 3. Présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.- L'insertion du fragment d'ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxième antibiotique (tétracycline).
IGNEMENT SUPERIEUR
UNIVERSITE DE LA MANOUBA
INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)SUPPORT DE COURS de
GENIE GENETIQUE
LF3ECUE Génie Génétique
Elaboré par :
Dr. KHOUAJA Fattouma
Année Universitaire 2019/2020
2Code UE
ECUE n° 2 Génie Génétique
Code ECUE
Chapitre 2. Les Outils du génie génétique1. Les enzymes
1.1. Enzymes de restriction
1.2. Ligases
1.3. Polymérases
1.4. Autres enzymes
2. Les vecteurs de clonages
2.1. Plasmides
2.2. Phages
2.3. Cosmides
2.4. BAC
2.5. YAC
2.6. Autres vecteurs (vecteurs viraux eucaryotes...)
3. Les cellules hôtes
3.1. Bactéries
3.2. Levures
3.3. Cellules animales et végétales
Chapitre 3. Les Méthodes de clonage
1. Vecteurs de clonage
3. Importance des marqueurs de sélection
4. Etapes de clonage et construction des Banques géomplémentaires
5. Sélection et criblage moléculaire
4.1. Méthodes de sélection de clones recombinants
4.2. Techniques de criblage des clones par hybridation avec une sonde
oligonucléotidique marquée 5. Le5.1. Méthode chimique de Maxam et Gilbert
5.2. Méthode enzymatique de Sanger
6. La PCR, RT-PCR, PCR-RFLP et leurs applications
1. Synthèse de substances utiles
2. Diagnostic des maladies héréditaires
4. Transgénèse : Animaux transgéniques et knock-out (intérêts et objectifs, les constructions, la
méthodologie)5. Thérapie génique : Intérêts et objectifs, Les constructions, La méthodologie
3 Planche 1 : carte de restriction du plasmide pBR322Planche 2 : carte de restriction du plasmide
pUC18/19 (MCS : multiple cloning sites = région à sites multiples de clonage) Planche 3 : carte de restriction du plasmide pBluescript II SK 4Dans le site multiple de clonage (MCS) on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des
promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un gène de l'ADN étranger, qu'il soit
inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6 kbp en moyenne et devant attendre
de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.Après assemblage in vitro, les cosmides sont capables de se fixer sur la paroi de la cellule hôte et d'injecter
leur ADN. Celui-ci grâce aux extrémités cos se circularise et se réplique comme un plasmide mais aucune
des fonctions phagiques ne peut être exprimée. De ce fait, les cellules survivent et forment des clones.
Planche 4 : C constitution d'une banque
5 ((221155 KKbb))Planche 5 Agrobacterium tumefaciens
" Left border » et " right border » : Bordures gauche et droite de la région T du pTi Ce sont des vecteurs permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans les cellules d'E. coli. Ce sont des ADN circulaires, dont l'origine de réplication (OriS) est issue de l'épisome sexuel F de E. coli. Les gènes " parB » et " parA » de l'épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène " repE » code pour l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. Le gène " CosN » vient du bactériophage . Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. Le gène " CmR » d'origine plasmidique code pour la résistance au chloramphénicol. Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F). Il pénètre dans les cellules hôtes par transformation en présence de chlorure de calcium ou par électroporation. Les vecteurs recombinants sont ensuite sélectionnés sur des clones bactériens. Planche 6 : Les BAC (Chromosome Artificiel de Bactérie) 6Planche 7 : carte fonctionnelle du pYAC
Les YAC sont des vecteurs des cellules
eucaryotes. Ils permettent de cloner de très grands fragments d'ADN (100 à 2000 kb) dans les cellules de la levureSaccharomyces cerevisiae. La pénétration
dans les cellules hôtes se fait soit par transformation en présence d'ions de calcium ou de PEG (polyéthylène glycol) soit par électroporation. 7Planche 8 : 2
Ligation
Incubation en présence de ligase
Produits de ligation
Plasmides intacts
Qui se sont recircularisés sans
Plasmides recombinants
Transformation bactérienne par le produit de ligation C'est-à-dire introduction du plasmide vecteur dans la bactérie hôteObtention de 3 populations de bactéries
pBR322Bactéries non transformées :
AmpS TetS
Bactéries transformées (AmpR Tet?) par :
- un plasmide intact non recombinant : AmpR TetR - un plasmide recombinant : AmpR TetS Le gène de résistance à la Tet est inactivé suite àSélection par étalement des bactéries sur un milieu de culture + Amp AE seules les bactéries transformées vont se développer sur ce 1er
milieu (AmpR Tet?). Ensuite, les colonies apparues sur ce milieu seront repiquées sur un milieu contenant Amp + Tet AE seules
les bactéries transformées par un plasmide non recombinant vont se développer sur ce 2ème milieu (AmpR TetR). les colonies
qui ont poussé sur le 1er et non sur le 2ème sont celles transformées par un plasmide recombinant ((AmpR TetS)
AmpR TetR
AmpR TetS
Boite de pétri
AmpR Tet ?
M. + Amp
M. + Amp + Tet
Repiquage
Digestion BamH1
Vecteur linéarisé
Digestion BamH1 qui donne des
TetR BamHIAmpR Pst1
8Planche 9 :
ADN radiomarquée
c Réplique de la banque : repiquage des clones qui constituent la banque sur plusieurs boites de pétriT empreinte de chaque boite sur
une membrane (ou filtre) de nitrocellulose ou nylon pour fixer quelques bactéries de chaque cloneEmpreinte
Filtre
Boite de
pétri e traitement du filtre par la soude (NaOH) : lyse des bactéries, fixation de dénaturationADN sb
Filtre
f hybridation moléculaireADN / sonde
Solution
contenant les 8 séquences radiomarquéesFiltre
g élimination de tous les hybridés par plusieurs lavagesU révélation de la
radioactivité par autoradiographieFilm révélé au RX
i retour à la boite initiale : le clone recherché est repéré la tache radioactive plasmidique recombinant, couper partie du gène par PCR ou par séquençageLe clone bactérien
transformé par un vecteur recombinant ayant inséré le gène recherché 9Planche 10 : Technique de coupure - réparation
10Planche 11 : Technique du random-priming
11 12 13 -Dénaturation -95°C pour séparer les 2 brins-Hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (50 à 60°C qui dépend du % en GC).
-dénaturation Tmpour un oligonucléotide < 30 nt. La Tm est estimée en utilisant la relation suivante : Tm = 2 (A
+ T) + 4 (G + C) Les 2 oligonucléotides font ~ 15-25nt et doivent avoir des Ta voisines. -Extension ou élongation 14Principe de
Cette technique peut être réalisée sur des produits PCR amplifiés par des enzymes de restriction.PCR ou digestion par
des enzymes de restriction 15Analyse du polymorphisme par RFLP
ouple enzyme/sonde pour détecter une mutation qui supprime ou crée un site de restrictionLes étapes de la technique RFLP
c T à des sites de restriction (ou PCR dans le cas eséparer les fragments de restriction. La révélation au BET ne permet pas de distinguer individuellement
les fragments car ils sont trop nombreux (traînée de coloration le long de la piste de migration =
smeer), en plus il est impossible de repérer les fragments homologues. Pour cela, il est nécessaire
f Transfert selon Southern g Hybridation moléculaire par des sondes ADN marquées (radioactives ou fluorescentes)U Révélation par Autoradiographie.
16 (a) (b (c 3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétisé qui est complémentaire etSens de migration
Sens de migration
3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétiséHaut poids
moléculaire faible poids moléculaireAmorce ADN simple brin
synthétisé Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP (suite page suivante) 17 (d) (e) (suite): Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) Cette technique consiste à la synthèse in vitroamorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides de synthèse modifiés et analogues structuraux de
nucléotides: les didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du groupement OH
hosphate suivant. Une fois de leur incorporation AE (b)Etapes du séquençage selon SangerQuatre réactions sont pré
ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs normaux. Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts
(c)Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (pouvant séparer
(marquage radioactif de la sonde par fluorescence).résultats obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours le plus vite). La lecture de
AE AE AE (d) fluorochromes différentsActuellement, le séquençage est devenu automatisé : " séquençage automatique » qui présente le même
séquençage les plus récentes marquent les 4 types de ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes
spécifiques pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE (vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)) : gel de séquence et les données de séquence sont enregistré grâce à un rayonlaser qui capte la fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la migration des
fragme enregistrée et interprétée dans la banque de données de Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans le même tube (e) : Electrophérogramme de séquençageLes séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à
1000 pb pour les appareils les plus performants
18Animaux transgéniques et knock-out
Figure 1 . Le génotype commande le phénotype Figure 2 . La technique du Knock Out consiste en le remplacement des deux copies d'un gène, dans le génome de l'organisme, par un autre allèle (le plus souvent, inactif)Figure 3 . Il est nécessaire de disposer du gène à invalider et des séquences le bordant dans le
génome avant de pouvoir procéder à son invalidation 19La technique d'invalidation d'un
gène se base sur la recombinaison homologue : On peut ainsi remplacer le gène complet, présent dans le génome de l'organisme, par une version suffisamment incomplète du gène pour qu'il ne s'exprime pas, ou par un autre gène (ce qui permet de suivre l'expression du gène invalidé). Figure 4 . Un exemple de méthode pour invalider un gène : le remplacer par un autre gène, par exemple un gène "rapporteur" tel que le gène lac Z (qui code pour la ß-galactosidase) La description suivante est faite chez la souris. Elle est valable pour tout organisme Mammifère. Figure 5 . Un exemple de vecteur de recombinaison homologue : plasmide bactérien portant legène lac Z (qui remplace le gène invalidé), avec en amont et en aval des séquences qui entourent
le gène à invalider dans le génome de l'organisme 20Figure 6 . Réalisation de cellules ES modifiées. A. Un vecteur a été réalisé : plasmide portant le
gène lac Z (dans notre exemple), entouré des cellules bordant le gène A dans le génome. Ce
vecteur est introduit dans des cellules ES (transfection). B. Dans quelques cellules ES, un
évènement de recombinaison homologue a lieu : grâce à une reconnaissance des séquences
communes entre le vecteur et le génome de la cellule, une copie du gène A est remplacée par la
construction portée par le vecteur (ici, le gène lac Z). C. La majorité des cellules ES n'ont en fait
pas réalisé cette recombinaison homologue. Les quelques cellules ES qui l'ont réalisée sont
sélectionée, multipliées, et vont permettre la suite du protocole. Figure 7 . L'injection de cellules ES recombinées dans de très jeunes embryons de souris (cescellules s'intègrent à l'embryon) permet l'obtention d'individus mosaïques, dérivant pour partie
de cellules non modifiées, et pour partie de cellules recombinées 21Figure 8 . Le croisement d'une souris mosaïque (dont les cellules sexuelles dérivent des cellules
ES recombinées) avec une souris sauvage ne possédant pas cette mutation permet d'obtenir, pour50% de la descendance, des souris hétérozygotes pour cette mutation.
Figure 9 . Le croisement des hétérozygotes obtenus précédemment entre eux permet l'obtention
(dans la proportion de 1/4 de la descendance) d'individus homozygotes : ce sont les individus "KO", chez qui le gène a été invalidé 22Figure 10 . L'invalidation d'un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de
l'organisme, par une version modifiée, inactive de ce gène. Dans cet exemple, le gène A estremplacé par un autre gène, lac Z. Ce remplacement est permis par la présence de séquences
identiques entre la construction et le génome de l'organisme, au niveau desquelles peut se
réaliser une recombinaison homologueFigure 11 . Bilan : différents résultats sont obtenus, grâce à la recombinaison homologue, en
fonction de la construction réalisée au départ : Knock Out (invalidation du gène), Knock In
(remplacement par un autre gène), ou mutagenèse dirigée (remplacement par un allèle muté).
2323
Fig 1 : Essais cliniques approuvés de thérapie génique dans le monde Fig 2 : Essais cliniques de thérapie génique Méthodologie de la TG moyennant des vecteurs viraux : Une méthode en 4 étapes :
Etape c
Grâce aux connaissances relatives au génome humain, on parvient facilement et rapidement à isoler un gène et à le cloner (PCR) cellule-cible Le vecteur généralement utilisé est un virus : adénovirus et rétrovirus. Thérapie génique Intérêt, objectifs, constructions et méthodologie 2424
Pour produire ces vecteurs viraux, Ces ¢
expriment, normalement, les protéines virales formant la capside de façon stable. En thérapeutique conduit à la formation de particules virales complètes contenant vecteur. Étape e : Administration du vecteur (3 protocoles ),De nombreux essais cliniques de thérapie génique ont utilisé une stratégie de protocole dite ex
vivo, c'est-à-direde transfert du gène thérapeutique en dehors de l'organisme. Les cellules sont ensuite
réinjectées au patient. Cela permet aux chercheurs dans certains cas d'évaluer l'ampleur de la
modification génétique tant au niveau du pourcentage de cellules modifiées génétiquement qu'au
niveau de l'expression des protéines thérapeutiques, ou de présélectionner des populations
cellulaires particulières (ex.: les cellules souches sanguines). Néanmoins, certaines stratégies,
notamment celles visant à éliminer des tumeurs, ou celles visant à modifier génétiquement des
cellules qu'on ne peut manipuler hors de l'organisme, utilisent une approche dite in vivo en
injectant directement le vecteur dans le tissu ciblé et en le laissant agir librement. 2525
la thérapie génique ex vivo :
prélever sur le patient les cellules cibles, les modifier génétiquement avec le vecteur viral
porteur du gène d'intérêt thérapeutique, puis à les réintroduire chez le patient. Cette
méthode est en particulier utilisée pour les cellules sanguines, faciles à prélever et à
réintroduire. la thérapie génique in situ : le vecteur de transfert est directement injecté au sein du tissu cible la thérapie génique in vivo :elle consiste à injecter le vecteur portant le gène d'intérêt thérapeutique directement
dans la circulation sanguine, celui-ci devant atteindre spécifiquement les cellules ciblesÉtape f
Pour infecter une cellule, la particule virale
se fixe d'abord à la membrane cellulaire. Les gènes viraux sont libérés dans le noyau et, qu'ils soient intégrés ou non au génome cellulaire, ils utilisent la machinerie de réplication de la cellule pour produire de nouvelles particules virales. Ces dernières pourront aller infecter d'autres cellules. Lorsque le virus est modifié pour être utilisé comme vecteur de transfert, les gènes codant pour les protéines virales sontquotesdbs_dbs10.pdfusesText_16[PDF] clonage moléculaire étapes
[PDF] tout sur les vecteurs de clonage
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