[PDF] TP BT06 MS_LCESI_2012 QTOF Abondance isotopique = pourcentage des isotopes

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Spectrométrie de masse - Introduction

Intérêts de la Spectrométrie de masse :

• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions ) • Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions. • Progrès technologique rapide 1

Spectrométrie de masse -

Introduction - Principes- Un spectromètre comprend : - Système d"introduction ( GC, LC , sas d"intro direct, ... ) - Source d"ionisation - Analyseur ( un ou plusieurs )

Détecteur pour compter les ions

2

Détecteur pour compter les ions

- Système de traitement de donnée

Introduction,

GC, LC

Ionisation,

EI, CI

ESI, APCI

FAB, ...

Analyseur

SQ D,TQD,

EB, TOF

Détecteur

Logiciel

Spectrométrie de masse -

Introduction - PrincipesPrincipes de la MS :• 1er étape : Produire des ions• La quantité de fragments produit dépend de la " force » de l"ionisation

3 Les ions sont ensuite séparés d"après leur masse et leur charge dans le système dispersif

Ils sont ensuite détectés. Introduction,

GC, LC

Ionisation,

EI, CI

ESI, APCI

FAB, ...

Analyseur

SQ D,TQD,

EB, TOF

Détecteur

Logiciel

Spectrométrie de masse -

Analyse de Biomolécules

-Electrospray (ESI) 4 Ion moléculaire ou pseudoIon moléculaire ou pseudo--moléculairemoléculaire Ion Ion pseudopseudo--moléculairemoléculaire En mode En mode positifpositif : : ajoutajout d"und"un proton sur M : (M+H)proton sur M : (M+H) (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1) En mode En mode négatifnégatif : : perteperte d"und"un proton : (Mproton : (M--H)H) (masse : M(masse : M--1, charge 1, charge --1)1)

ElectrosprayElectrospray

1. Massifs isotopiques

•Isotopes : atomes d"un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais

un nombre différent de neutrons •Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d"un élément dans la nature

•Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique et

qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre de

protons : nucléons : nbre nbre de nbre masse abondance abondance atomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2) nbre nbre de nbre masse abondance abondance atomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)

Chlore-35 17 35 35-17 = 18

34,97
75,8%

100Chlore-37 17 37 37-17 = 20

36,97
24,2%
32,5

Masse moyenne pondérée du chlore = (

0,758 * 34,97 uma 0,242 * 36,97 uma ) = 35,454 uma 6 (1)= nombre moyen d"isotope cité pour 100 atomes de l"élément (2)= nombre moyen d"isotope cité pour 100 isotopes majoritaires

Calcul de masses exactes

282
nbre masse masse

A isotopique moyenne

Hydrogène-1 1 1.0078

1.0079

Hydrogène-2 2 2.0140Carbone-12 12 12.0000

12.011

Carbone-13 13 13.0034

Soit la molécule

d"eicosane C 20H 42

Masse exacte M :

12C 201
H 42)
(20 *

12.000

Masse exacte M+1

Masse exacte M+1

Masse moyenne :

(20 *

12.011

+ (42 *

1.0079

= 282,55 (20 *

12.000

+ (42 *

1.0078

= 282,33avec un 13C : (19 *

12.000

+ (1 *

13.0034

+ (42 *

1.0078

= 283,33

Masse exacte M+1avec un

2H : (20 *

12.000

+ (41 *

1.0078

+ (1 *

2.0140

= 283,33

La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : DDDDentre

MM et M = ±±±±1 Da / 1500 Da

Calcul de l'abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour des petites molécules Type d"élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2

ème

isotope*

1! Isotope ou F -

Q plusieurs isotopesI-

dont un est majoritaire P - (A > 99,9%) H 0,015

Q+1 Isotope M+1 C

1,08 non négligeable N 0,37 * Abondance de l"isotope majoritaire = 100 analyse de spectres de masse9 O 0,2

Q+2 Isotope M+2 S

4,43 non négligeable Cl

31,98Br 97,28

M+1 1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) M M+2 31,98
. Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ...... M

SatelliteM+1 :

SatelliteM+2 :

100
100

Massifs isotopiques complexes

Exemple

: Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

En Conclusion :

Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre

Pour des molécules de masse < 500 Da

L"abondance des pics " M+1 » renseigne sur le nombre d"éléments Q+1 : M+1/M »»»»(1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100 L"abondance des pics " M+2 » et suivants renseigne sur la présence d"éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes : analyse de spectres de masse11 Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

Formules brutes* contenant 12C, 1H, 14N et 16O

entre

180.000 et 180.200 :

! Le nombre de formules brutes dont la masse est comprise entre deux

valeurs données augmente avec la masse de l"entitéFormules brutes* Formules brutes* contenant contenant 1212C, C,

11H, H,

1414N et N et

1616O O

entre 28.000 et 28.200 :entre 28.000 et 28.200 :

CO : 28.000N

2 : 28.006

N

2 : 28.006

CH

2N : 28.019*

C 2H

4 : 28.031

La capacité d"un spectromètre à distinguer une masse x d"une masse y dépend de la résolution ...

Résolution= m / Dm

Si la résolution est suffisante, on peut alors associer une masse donnée à une seule formule

brute DDDDm = différence de masse correspondant à deux pics adjacents tout juste séparés m = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics)

Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des

valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01) analyse de spectres de masse 13 Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallée qui les sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la hauteur du pic le moins intense (généralement 10% pour la haute résolution et 50% pour la basse résolution) Autre définition (pour un pic isolé) = résolution FWHM : DDDDm = largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse : résolution

FWHM / résolution à 10% = 2,2

Remarque : Un autre paramètre important de l"analyseur est l"exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l"analyseur.

Résolution= m / Dm

Remarque : Un autre paramètre important de l"analyseur est l"exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l"analyseur. analyse de spectres de masse 14

Basse Résolution et Haute Résolution

Formule Brute : Masse exacte M

12C 1H 4

16,0313

13C 1H

417,0346

12C 2571
H 38314
N 6516
O 77 32
S

6*5 803,6377

13C 12C 2561
H 38314
N 6516
O 7732
S

6*5 804,6401

14N 2

28,00615

12C 1H

28,0312

DDDDm R = m/DDDDm

1,0033 16

1,0033 6 000

0,025 1 100

Spectromètre

HR ou BR ?

BR HRBR

Entités

identiques dont l"une contient un 13C analyse de spectres de masse 15 12C 21H
4

28,0312

12C 9 14 N 4 16

O 180,0073

12C 111
H 2 14 N 16O 2

180,0085

12C 2571
H 38314
N 6516
O 77 32
S

6*5 803,6377

12C 2591
H 38514
N 6216
O 7832
S 6

5 803,63900,0013 140 0000,0013 4 500 000

* Insuline Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque 500 000

HR = haute résolution : R de l"ordre de 10

4-105- BR = Basse résolution : R de l"ordre de 103

BRHRImpossibleà séparer

Entités ≠

mais de masses très proches

En Conclusion :

La résolution détermine la capacité d"un spectromètre de masse à différencier deux masses : R = m / DDDDm

Pour des molécules de masse < 1000 Da

Les spectromètres à haute résolution permettent d"associer une masse donnée à une formule bruteformule brute

Pour des molécules de masse > 1000 DaCe n"est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut parfois

distinguer les satellites isotopiques (DDDDm = 1)

NB : N'oubliez pas que l'analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l'attribution d'une formule

brute

Spectrométrie de masse -

Quantification

La La sensibilité = recherche de la limite de détection(LOD) et Quantification (LOQ). En analyseQualitative, la LOD est la quantité minimal d"échantillon nécessaire à l"obtention d"un spectre de masse de qualité. En analyseQuantitativela LOD est la quantité minimal détectable d"une molécule par rapport au bruit de fond. 17

LOD = 3 S/N

LOQ = 10 S/N

Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :

- Paramètre de source du spectromètre de masse - La techniqued"ionisation - les solvants et tampon en ESI 18

Spectrométrie de masse -

Analyse de Biomolécules

MRM, des limitations ...

1. La molécule doit s"ioniser, surtout en ESI

2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop3.

Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu"à 6 (TQD ) 3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu"à 6 (TQD )

4. Précision des mesures : 10%

5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareils ( 20 pg pour la

carnitine sur TQD Waters de 2000), inférieur sur une Maxis Q-TOF de 2009.

6. Répétabilité des aires : mauvais d"un jour à l"autre

1. lié à l"encrassement

2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).

On préfère toujours la solution de l"étalon interne à la courbe de calibration externe Idéalement, l"étalon interne est la molécule marqué iso topiquement (

Testostérone D3, Carnitine D3.

Spectrométrie de masse -

Quantification

La spectrométrie de masse apporte :La spectrométrie de masse apporte :- Spécificité- La sensibilité

19 La La spécificité est obtenu par :est obtenu par : - La préparation de l"échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences. - Le spectromètre de masse en lui même La La sensibilité est obtenu par :est obtenu par : - La technologie employée - Les modes du spectromètre de masse

Spectrométrie de masse

Quantification

La La spécificité est obtenu par :est obtenu par : - La purification de l"échantillon - Extraction ( liquide liquide ) - SPE / MIP - La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d"intêret et ciblage d"ion caractéristique de masse supérieur. -

Le spectromètre de masse.

20 Le spectromètre de masse.- Augmenter la résolution - R= 2000 TQD - R= 20 000 Q-TOF - - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .

Quantitatif

1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d "étalon interne.

2. Concentré l"échantillon avec la même quantité d"étalon interne que pour la calibration

3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d"étalon interne.

Cpd # Formula RT Mass [M+H]+

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