LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE DADN
Il existe 3 types de vecteur de clonage : plasmidiques viraux et cosmides (phage associés à des plasmides). Les-vecteurs plasmidiques de première génération
Génie Génétique
1.Vecteur de clonage : renferme une origine de réplication et permet de cloner un segment d'ADN ou un gène qui y est intégré.
Cours de Biologie Moléculaire et Génie Génétique
Vecteur de clonage: Elément génétique capable de se répliquer et permettant le transfert dans une cellule réceptrice d'un fragment d'ADN étranger préalablement
SUPPORT DE COURS de - GENIE GENETIQUE
Le plasmide pBR 322 de 4361 pb de taille est l'un des 1ers plasmides artificiels utilisés comme vecteur de clonage. Il possède 2 gènes de résistance aux
Génie génétique.pdf
pUC appelés (les vecteurs de clonage de secondes génération). • Les vecteurs de clonage de seconde génération ce sont des petits plasmides d'environ 2700pb. Le
GENIE GENETIQUE
Ce sont des vecteurs permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans les cellules d'E. coli. Ce sont des ADN circulaires dont l'origine de
Les enzymes « outils » du génie génétique
Le gène d'intérêt cloné dans un vecteur d'expression doit donc être cloné après un promoteur spécifique pour l'ARN polymérase présente dans la cellule hôte. On
hotes de clonage - Génie Génétique
Exemple : si le vecteur est un plasmide la cellule hôte est une bactérie. La cellule hôte ne doit pas modifier ou détruire l'ADN recombiné. Page 4. HOTES
Génie génétique
Le génie génétique est un ensemble de techniques de les enzymes du génie génétique ... pUC appelés (les vecteurs de clonage de secondes génération).
Exposé réalisé par:
Les plasmides vecteurs de clonage par génie génétique à des fins de clonage ... sur le génie génétique qui regroupe les techniques permettant de.
IGNEMENT SUPERIEUR
UNIVERSITE DE LA MANOUBA
INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)SUPPORT DE COURS de
GENIE GENETIQUE
LF3ECUE Génie Génétique
Elaboré par :
Dr. KHOUAJA Fattouma
Année Universitaire 2019/2020
2Code UE
ECUE n° 2 Génie Génétique
Code ECUE
Chapitre 2. Les Outils du génie génétique1. Les enzymes
1.1. Enzymes de restriction
1.2. Ligases
1.3. Polymérases
1.4. Autres enzymes
2. Les vecteurs de clonages
2.1. Plasmides
2.2. Phages
2.3. Cosmides
2.4. BAC
2.5. YAC
2.6. Autres vecteurs (vecteurs viraux eucaryotes...)
3. Les cellules hôtes
3.1. Bactéries
3.2. Levures
3.3. Cellules animales et végétales
Chapitre 3. Les Méthodes de clonage
1. Vecteurs de clonage
3. Importance des marqueurs de sélection
4. Etapes de clonage et construction des Banques géomplémentaires
5. Sélection et criblage moléculaire
4.1. Méthodes de sélection de clones recombinants
4.2. Techniques de criblage des clones par hybridation avec une sonde
oligonucléotidique marquée 5. Le5.1. Méthode chimique de Maxam et Gilbert
5.2. Méthode enzymatique de Sanger
6. La PCR, RT-PCR, PCR-RFLP et leurs applications
1. Synthèse de substances utiles
2. Diagnostic des maladies héréditaires
4. Transgénèse : Animaux transgéniques et knock-out (intérêts et objectifs, les constructions, la
méthodologie)5. Thérapie génique : Intérêts et objectifs, Les constructions, La méthodologie
3 Planche 1 : carte de restriction du plasmide pBR322Planche 2 : carte de restriction du plasmide
pUC18/19 (MCS : multiple cloning sites = région à sites multiples de clonage) Planche 3 : carte de restriction du plasmide pBluescript II SK 4Dans le site multiple de clonage (MCS) on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des
promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un gène de l'ADN étranger, qu'il soit
inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6 kbp en moyenne et devant attendre
de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.Après assemblage in vitro, les cosmides sont capables de se fixer sur la paroi de la cellule hôte et d'injecter
leur ADN. Celui-ci grâce aux extrémités cos se circularise et se réplique comme un plasmide mais aucune
des fonctions phagiques ne peut être exprimée. De ce fait, les cellules survivent et forment des clones.
Planche 4 : C constitution d'une banque
5 ((221155 KKbb))Planche 5 Agrobacterium tumefaciens
" Left border » et " right border » : Bordures gauche et droite de la région T du pTi Ce sont des vecteurs permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans les cellules d'E. coli. Ce sont des ADN circulaires, dont l'origine de réplication (OriS) est issue de l'épisome sexuel F de E. coli. Les gènes " parB » et " parA » de l'épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène " repE » code pour l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. Le gène " CosN » vient du bactériophage . Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. Le gène " CmR » d'origine plasmidique code pour la résistance au chloramphénicol. Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F). Il pénètre dans les cellules hôtes par transformation en présence de chlorure de calcium ou par électroporation. Les vecteurs recombinants sont ensuite sélectionnés sur des clones bactériens. Planche 6 : Les BAC (Chromosome Artificiel de Bactérie) 6Planche 7 : carte fonctionnelle du pYAC
Les YAC sont des vecteurs des cellules
eucaryotes. Ils permettent de cloner de très grands fragments d'ADN (100 à 2000 kb) dans les cellules de la levureSaccharomyces cerevisiae. La pénétration
dans les cellules hôtes se fait soit par transformation en présence d'ions de calcium ou de PEG (polyéthylène glycol) soit par électroporation. 7Planche 8 : 2
Ligation
Incubation en présence de ligase
Produits de ligation
Plasmides intacts
Qui se sont recircularisés sans
Plasmides recombinants
Transformation bactérienne par le produit de ligation C'est-à-dire introduction du plasmide vecteur dans la bactérie hôteObtention de 3 populations de bactéries
pBR322Bactéries non transformées :
AmpS TetS
Bactéries transformées (AmpR Tet?) par :
- un plasmide intact non recombinant : AmpR TetR - un plasmide recombinant : AmpR TetS Le gène de résistance à la Tet est inactivé suite àSélection par étalement des bactéries sur un milieu de culture + Amp AE seules les bactéries transformées vont se développer sur ce 1er
milieu (AmpR Tet?). Ensuite, les colonies apparues sur ce milieu seront repiquées sur un milieu contenant Amp + Tet AE seules
les bactéries transformées par un plasmide non recombinant vont se développer sur ce 2ème milieu (AmpR TetR). les colonies
qui ont poussé sur le 1er et non sur le 2ème sont celles transformées par un plasmide recombinant ((AmpR TetS)
AmpR TetR
AmpR TetS
Boite de pétri
AmpR Tet ?
M. + Amp
M. + Amp + Tet
Repiquage
Digestion BamH1
Vecteur linéarisé
Digestion BamH1 qui donne des
TetR BamHIAmpR Pst1
8Planche 9 :
ADN radiomarquée
c Réplique de la banque : repiquage des clones qui constituent la banque sur plusieurs boites de pétriT empreinte de chaque boite sur
une membrane (ou filtre) de nitrocellulose ou nylon pour fixer quelques bactéries de chaque cloneEmpreinte
Filtre
Boite de
pétri e traitement du filtre par la soude (NaOH) : lyse des bactéries, fixation de dénaturationADN sb
Filtre
f hybridation moléculaireADN / sonde
Solution
contenant les 8 séquences radiomarquéesFiltre
g élimination de tous les hybridés par plusieurs lavagesU révélation de la
radioactivité par autoradiographieFilm révélé au RX
i retour à la boite initiale : le clone recherché est repéré la tache radioactive plasmidique recombinant, couper partie du gène par PCR ou par séquençageLe clone bactérien
transformé par un vecteur recombinant ayant inséré le gène recherché 9Planche 10 : Technique de coupure - réparation
10Planche 11 : Technique du random-priming
11 12 13 -Dénaturation -95°C pour séparer les 2 brins-Hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (50 à 60°C qui dépend du % en GC).
-dénaturation Tmpour un oligonucléotide < 30 nt. La Tm est estimée en utilisant la relation suivante : Tm = 2 (A
+ T) + 4 (G + C) Les 2 oligonucléotides font ~ 15-25nt et doivent avoir des Ta voisines. -Extension ou élongation 14Principe de
Cette technique peut être réalisée sur des produits PCR amplifiés par des enzymes de restriction.PCR ou digestion par
des enzymes de restriction 15Analyse du polymorphisme par RFLP
ouple enzyme/sonde pour détecter une mutation qui supprime ou crée un site de restrictionLes étapes de la technique RFLP
c T à des sites de restriction (ou PCR dans le cas eséparer les fragments de restriction. La révélation au BET ne permet pas de distinguer individuellement
les fragments car ils sont trop nombreux (traînée de coloration le long de la piste de migration =
smeer), en plus il est impossible de repérer les fragments homologues. Pour cela, il est nécessaire
f Transfert selon Southern g Hybridation moléculaire par des sondes ADN marquées (radioactives ou fluorescentes)U Révélation par Autoradiographie.
16 (a) (b (c 3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétisé qui est complémentaire etSens de migration
Sens de migration
3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétiséHaut poids
moléculaire faible poids moléculaireAmorce ADN simple brin
synthétisé Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP (suite page suivante) 17 (d) (e) (suite): Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) Cette technique consiste à la synthèse in vitroamorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides de synthèse modifiés et analogues structuraux de
nucléotides: les didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du groupement OH
hosphate suivant. Une fois de leur incorporation AE (b)Etapes du séquençage selon SangerQuatre réactions sont pré
ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs normaux. Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts
(c)Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (pouvant séparer
(marquage radioactif de la sonde par fluorescence).résultats obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours le plus vite). La lecture de
AE AE AE (d) fluorochromes différentsActuellement, le séquençage est devenu automatisé : " séquençage automatique » qui présente le même
séquençage les plus récentes marquent les 4 types de ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes
spécifiques pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE (vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)) : gel de séquence et les données de séquence sont enregistré grâce à un rayonlaser qui capte la fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la migration des
fragme enregistrée et interprétée dans la banque de données de Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans le même tube (e) : Electrophérogramme de séquençagequotesdbs_dbs1.pdfusesText_1[PDF] les vents qui soufflent au sénégal
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