[PDF] Les enzymes « outils » du génie génétique

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Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 1

Le Génie Génétique

Définition

Le génie génétique est un ensemble de méthodes et de techniques permettant d'identifier d'isoler de cloner de transférer de modifier de manière contrôlée le matériel génétique.

I- Les outils du génie génétique

Définition du génie génétique

Les outils de base du génie génétique

Les enzymes agissant sur les acides nucléiques

Les vecteurs

II- Techniques de base en génie génétique

I. Les outils du Génie Génétique

Ils permettent de travailler avec les acides nucléiques, de les modifier, de les couper, de les associer etc...

1. les nucléases (DNases et RNases)

1-1. Les DNases

terminant, généralement, phosphate(Toutes les DNases ont besoin d'ions compor . On distingue les exonucléases qui digèrent l'ADN en retirant les nucléotides à partir de l'extrémité et les endonucléases

1-1-1. Les exonucléases

exonucléase III est une 3' d'une manière séquentielle à partir de l'extrémité 3' (à la condition qu'elle ne soit simple brin).

T7Gene exonucléase

phosph

T7Gene exonucléase

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1-1-2. Les endonucléases

Les endonucléases ont diverses spécificités de substrat, certaines coupent l'ADN double brin d'autre l'ADN

simple brin enfin certaines reconnaissent et coupent au niveau de séquences caractéristiques.

DNase I

Nucléase S1 : hydrolyse simple brin.

Les endonucléases de restriction (ou enzyme de restriction) :

Les endonucléases de restriction sont des enzymes bactériennes participant à un mécanisme de défense des

bactéries vis-à- méthyla zyme de restriction.

à-vis des phages.

: Le type I reconnaît une séquence d'ADN, puis se déplace, s'arrête

1000 à 5000 paires de bases plus loin et libère quelques dizaines de nucléotides

Le type II, coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue, Le type III coupe une vingtaine de nucléotides plus loin que le site de reconnaissance.

Seuls les Enzymes de restriction de classe II sont utilisés en génie génétique : clivant spécifiquement les deux

brins de l' ADN au niveau d'une séquence, en général palindromique, parfaitement définie (de 4 à 8 nucléotides).

Le nom de chaque enzyme est dérivé du nom duit. On écrit (ou souche) et après un espace un chiffre romain pour désigner che, exemple :

EcoR I

Les enzymes de restriction sont des hydrolases, agissant sur des -à-dire des estérases. Elles catalysent la

par une séquence spécifique de nucléotides (site de restriction formé de 4 à 8 nucléotides).

gueur (bouts francs) nucléotides (bouts collants).

On appelle isoschizomères des enzymes qui reconnaissent et coupent la même séquence mais qui proviennent de

deux bactéries différentes. Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 3

EcoRV G A T A T C

EcoRI

G A A T T C

PstI C T G C A G

C T A T A G

C T T A A G

G A C G T C

5 5 3

3 G A T

C T A 5 3 5

3 A T C T A G

5 5 3

3 5 3 3 5 G

C T T A A

5 3 5

3 A A T T C

G 5 3 3 5

5 3 3 5

C T G C A

G 5 3 3 5 G

A C G T C

5 3 3 5 GCGC CGCG

Bouts cohésifs

Bouts cohésifs

Haemophilus aegytius HaeIII GGCC

CCGG

4 nucléotides Bouts francs

Thermus aquaticus TaqI TCGA

AGCT

4 nucléotides

Haemophilus

haemolyticus

HhaI 4 nucléotides

Escherichia coli EcoRV GATATC

CTATAG

6 nucléotides Bouts francs

Escherichia coli EcoRI GAATTC

CTTAAG

6 nucléotides Bouts

cohésif s

Providencia stuarti PstI CTGCAG

GACGTC 6

nucléotides

Bouts cohésifs

Enzyme Site de

restriction

Nature des

extrémités

Taille du site

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1-2. Les RNases

-RNAse A : coupe après (en 3') les résidus pyrimidiques (C, U). -RNAse H : digère l'ARN dans un complexe ARN-

2. Les polymérases

Toutes les polymérases synthétisent les acides nucléiques de 5' vers 3' en utilisant des nucléotides triphosphates.

2-1. Les ADN polymérases

On distingue les ADN polymérases, les reverse transcriptases et les terminal transférases

2-1-1. ADN polymérase

Elles synthétisent de l'ADN en prenant comme matrice de l'ADN. Les ADN polymérases ont besoin d'une base

déjà hybridée ou amorce. correction. En effe

polymérase I de E. coli : c'est une enzyme de 109 kDa qui a une activité 5'-3' polymérase, une activité 3'-5'

exonucléase (activité de correction) et une activité 5'-3' exonucléase. Cette activité 5'-

polymérase I est souvent gênante en biologie moléculaire. En 1970, Klenow et Henningsen ont enlevé cette

activité par protéolyse (en utilisant la subtilisine et donnant deux fragments). Le grand fragment protéique

obtenu (76 kDa) est dépourvu d'activité exonucléase 5'-3' mais garde l'activité polymérase et l'activité 3'-5'

exonuléase. Depuis le grand fragment est obtenu par expression d'un gène tronqué. C'est le fragment " Klenow »

T4 et T7 ADN polymérases :

--ité exonucléase de

Klenow lorsque cette activité est requise.

Les ADN polymérases thermostables

La Taq ADN polymérase

-3' exonucléase. Son avantage est d'être thermostable. Comme elle est dépourvue d'activité 3'-

5' exonucléase, le taux d'erreurs est d'environ 10

-4 par base dupliquée.

L'activité 5'-3' exonucléase a été enlevée en délétant l'extrémité N-terminal de la Taq pol.

La Taq pol possède une activité Adényl terminal transférase : elle ajoute à la de chaque élongation un seul A.

La Pfu et la Pwo DNA polymérase :Elles proviennent de Pyrococcus furiosus, bactérie découverte dans des

sources géothermiques en Italie et de Pyrococcus woesei. Elles ont les mêmes séquences et ont donc des activités

identiques. Activité 5'-3' polymérase et 3'-5' exonucléase mais pas d'activité 5'--5' -6 par base dupliquée. La Vent ADN polymérase Elle provient de Thermococcus littoralis -- Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 5

2-1-2 . Les reverses transcriptases

2-1-3. Terminal transférase: Cette polymérase n'a pas besoin de matrice comme les autres polymérases, elle

ajoute des nucléotides en 3' à l'extrémité du brin d'ADN. Elle ajoute des nucléotides en 3' en présence de dNTP.

Si on veut en ajouter qu'un seul, on ajoute un ddNTP.

Utilisation : Fabrication d'une queue homopolymére pour les clonages Fabrication d'une extrémité cohésive en 3'

Enzyme Template Primer Other activities Other features E. coli DNA pol I DNA DNA/RNA 3'-5' exo, 5'-3' exo monomeric

E. coli DNA pol

I (Klenow fragment) DNA DNA/RNA 3'-5' exo C-terminal fragment

E. coli DNA pol III DNA DNA/RNA 3'-5' exo (on a

separate subunit) multimeric structure

Taq pol DNA DNA/RNA extendase (adds 3'-A

overhangs) thermostable, used in PCR reverse transcriptase DNA/RNA DNA/RNA (ribonuclease H) used to make cDNA terminal transferase none required DNA will synthesize DNA in non- templated reaction

2-2. Les ARN polymérase

promoteur. La synthèse s'effectue dans le sens 5'-3' en présence de ribonucléotides.

polymérase, la T3 ARN polymérase et la SP6 ARN polymérase. Ces trois polymérases sont issues des phages

T7, T3 ou SP6 (exprimées chez certaines souches de E.coli qui servent de cellules hôtes) et reconnaissent

chacune un promoteur spécifique, ainsi la T7 ARN polymérase reconnaît le promoteur T7 mais pas les

promoteurs T3 ou SP6.

3) Les ligases

Elle catalyse la formation d'un pont phosphodiester entre une extrémité 3' OH et une extrémité 5' P. Elle a besoin d'ATP et ions divalents

T4 ADN ligase

Utilisation : ligation d'extrémités cohésives ou d'extrémités franches. Si les deux extrémités sont

déphosphorylés, la ligation ne peut avoir lieu, par contre si une seule est déphosphorylée, la ligation a lieu sur un des deux brins.

T4 ARN ligase

Catalyse la jonction entre un 5' phosphate d'un ARN ou d'un ADN simple brin avec un 3' OH (ions divalents et ATP) Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 6

4) Les phosphatases et kinases

Phosphatases alcalines

La plus utilisée est la phosphatase alcaline bovine. Elle catalyse le retrait du phosphate en 5'. Elle a besoin de

e 9 et 10 pour fonctionner et est stimulée par le magnésium. Elle est thermolabile, elle peut être inactivée par incubation à 65°C pendant une heure.

Les phosphatases alcalines sont utilisées par exemple pour déphosphoryler les vecteurs avant de liguer un insert

pour éviter sa recircularisation.

T4 polynucléotide kinase

marquage de l'extrémité 5' de l'ADN, marquage des oligonucléotides

5) Les méthylases

Les enzymes de restriction sont

bactérien ne soit pas lui-même digéré, la bactérie produit aussi des méthylases spécifiques qui inhibent la

digestion. Ainsi EcoR I ne coupe pas GA m6ATTC. On pourra utiliser ces méthylases pour inhiber la digestion Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 7 II Les vecteurs de clonage & les stratégies de clonage cellule alors

En biologie moléculaire et génie génétique, certains vecteurs sont étudiés pour faire entrer un acide

dans la cellule qui le reçoit.

Vecteur de clonage Taille de l'insert

Plasmide bactérien <10 Kb

Bactériophage

à insertion <10 Kb

Bactériophage

à remplacement 9-23 Kb

cosmides 35-45 Kb BAC (chromosome bactérien artificiel) jusqu'à 300 Kb

YAC (chromosome artificial de levure) 0.2-2.0 Mb

Les plasmides bactériens, les bactériophages et de nombreux virus sont des vecteurs naturels permettant la

artificiellement à partir de ceux-là grâce à des manipulations génétiques. Les cellules qui sont habituellement transformées par des vecteurs

Caractéristiques des vecteurs:

1. réplication indépendante de l'ADN de la cellule hôte.

2. petite taille: facilité de manipulation et pour permettre l'insertion de grand fragment d'ADN étranger

3. présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.

4. présence de sites de restriction uniques localisés dans les gènes de sélection: permet de sélectionner les cellules

hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant.

5. stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel que soit le nombre de division.

1-Les plasmides

Ce sont des molécules d'ADN extra chromosomiques présentes naturellement dans les bactéries ainsi que chez

certains Eucaryotes inférieurs. L'ADN plasmidique est circulaire, double brin et super enroulé. La taille de ces

plasmides peut varier de 2 à 200 kb. Le plasmide porte très souvent un ou plusieurs gènes de résistance à un

antibiotique (ou à une drogue), ce qui permet de repérer leur présence. Il possède une origine de réplication

indépendante de celle du/des chromosome(s) de l'hôte. Ces origines de réplication déterminent le nombre de copies

d'un même plasmide dans une cellule (peut varier de 1 à 700 copies/cellule). Les plasmides permettent de cloner des

Plasmides

(naturels) 1ère génération Tailles (Kb) Intervenant dans la conjugaison Nombres de copies par cellules phénotypes

R1 110 + 1 - 3 Résistance à des antibiotiques R6 110 + 1 - 3 Résistance à des antibiotiques

ColE1 7 - 15 -20 Production de colchicine

RSF1030 9,4 - 20 40 Résistance à

Plasmides

améliorés Tailles (Kb) Intervenant dans la conjugaison

Nombres de copies par

cellules phénotypes pBR322 (2ème génération) 4 ,36 - 15 -20 Résistance à tétracycline pUC18 (3ème génération) 2,69 - 500 700 Résistance à de la -galactosidase

Limite des vecteurs plasmidiques:

- faible taille de l'insert: max 8 à 10 kb - Pénétration du plasmide non-spontanée. Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 8

1-1. Le pBR322

Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire

double brin de 4361 paires de bases. Par convention le nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction

EcoR I en direction du gène tet

r. Il contient une origine de réplication (2535), un gène de résistance à la tétracycline (tet r 861276) et un gène de résis r 4153-3293).

Le gène amp

r ȕ-lactamase) de

286 acides aminés capable de cataboliser cet

antibiotique.

Le plasmide contient de nombreux sites de

restriction répartis sur toute la séquence. Beaucoup de ces sites sont uniques, permettant de transformer ple, le site

BamH I (position 375) au début du gène tet

r.

1-2. Les pUC

Les plasmides pUC18 et pUC19 sont des ADN

circulaires double brin de 2686 paires de bases (pb). Ils ont pb). e gène amp r qui difiée comprenant un polylinker (site multiple de clonage) et la séquence de la partie NH2 terminale du gène ȕ-galactosidase. Cette séquence est indispensable pour que la bactérie hôte puisse avoir complémentation). 1-

Comprend :

Promoteur (constitutif ou inductible)

Site de fixation des ribosomes

Polylinker / Multiple cloning site (MCS)

Signal de terminaison de transcription

Séquence Tag (pour la purification)

Codon Stop

Origine de réplication dans les bactéries

Gène de résistance à un antibiotique (marqueur de sélection) Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 9 Stratégie de clonage pour les plasmides pBR322 et pUC18 Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 10

2- Les virus

Le bactériophage lambda

Le bactériophage lambda, virus infectant E.coli, présente un génome sous la forme ADN double brin linéaire avec à ses deux extrémités 12 nucléotides simple brin complémentaires (extrémité cohésives ou cos).

A l'entrée dans la bactérie, les extrémités cohésives s'hybrident et l'ADN est lié par une ligase d'E. coli. Là,

il y a deux possibilités soit un cycle lysogénique avec intégration de l'ADN du phage dans le génome soit un cycle

lytique.

Dans les bactériophages utilisés comme vecteur de clonage, seul le cycle lytique est important. La

partie centrale du génome, contenant les gènes nécessaires au cycle lysogène sera donc délétée et remplacée par

l'ADN à cloner, qui pourra alors être amplifié lors du cycle lytique du bactériophage.

La seule limitation de ce système réside dans la longueur du fragment qui peut être introduit dans le phage. La taille

totale de l'ADN recombinant obtenu doit être comprise entre 85% et 105 % de la taille du génome originel afin que

l'encapsidation (assemblage du génome et de l'enveloppe du phage ou "capside") de cet ADN soit possible et que le

cycle lytique puisse se produire. Les bactériophages peuvent ainsi porter des fragments de 13 à 23kb environ.

Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 11 Stratégie de clonage moyennant le phage lambda comme vecteur Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech 12

3. Systèmes hybrides

efficace des bactéries. Des systèmes hybrides ont été réalisés à partir de ces 2 vecteurs :

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