[PDF] transmission inter-espèce dun plasmide portant un gène de métallo

!"#$%&'($)*!+,'$(-(".!//!!!!!!&012&!.10)1',2&!"!#$$%&'(#%$!()*+',-.(#/.-!"!0.!1%$0'2-$('3!'!34',,3#/.*!!"#$%&%'()*+,(+#+-($%.%/0$*1!$2/(32$4%15/(6(57$)/($24$4%%.$(0$+2$#&!3!4$0'15$1216$&!!!!!'$$*-!5675!8*+#-!0%9(%+'(!$:77;?@AB?A!CA!D6E6FE5675!!GHI!!29:;<=>B!MB@AIPA=GKJA!N4?B!GCH=LMNA!G>I@HB@!?B!QKBA!NA!LR@HCC>PST@HPCHJ@HLH=A!!!!Directeur de thèse : Vincent JARLIER PU-PH (Université Pierre et Marie Curie) Co-directeur de thèse : Wladimir SOUGAKOFF MCU-PH (Université Pierre et Marie Curie) Composition du jury : Président du jury : Thierry LAMBERT PU (Université Paris-Sud) Rapporteurs : Marie-Hélène NICOLAS-CHANOINE PU-PH (Université Paris Diderot) Christophe DE CHAMPS PU-PH (Université de Reims) Examinateurs : Isabelle PODGLAJEN MCU-PH (Université Paris Descartes)

3 REMERCIEMENTS A François et Thomas, A mon frère, A mes parents.

5 A Monsieur le Professeur Thierry Lambert, pour l'honneur qu'il me fait de juger ce travail et de présider ce jury A Madame le Professeur Marie-Hélène Nicolas-Chanoine, A Monsieur le Professeur Christophe De Champs, pour l'honneur qu'ils me font de juger ce travail et d'en être les rapporteurs A Madame le Docteur Isabelle Podglajen, pour l'honneur qu'elle fait de juger ce travail A Monsieur le Professeur Vincent Jarlier, A Monsieur le Docteur Wladimir Sougakoff, pour m'avoir confié ce travail et pour m'avoir accordé leur confiance A Dominique, pour son aide précieuse dans la réalisation de ce travail et dans la rédaction de ce manuscrit A Alexandra et Florence, pour leurs encouragements et leurs précieux conseils Aux membres de l'équipe de Bactériologie de la faculté de médecine Pitié-Salpêtrière, pour leur bonne humeur, leur aide, leurs encouragements, pour tous les bons moments et les gâteaux partagés avec l'équipe des amateurs de sushi et les danseuses du Moulin Rouge, Aux équipes de Bactériologie et Hygiène Hospitalière de l'hôpital Charles Foix, pour leur bonne humeur, leur soutien " opérationnel » et leur patience A l'équipe de Bactériologie de l'hôpital Pitié-Salpêtrière, pour leur bonne humeur et leur soutien A Caroline, Joëlle, Marie, Eurydice et Florence, pour leur précieuse amitié et leur soutien

Sommaire 7 SOMMAIRE SOMMAIRE............................................................................................................................................7 TABLE DES ILLUSTRATIONS.........................................................................................................9 Figures....................................................................................................................................................................9 Tableaux..............................................................................................................................................................12 ABREVIATIONS..................................................................................................................................13 INTRODUCTION GENERALE........................................................................................................15 PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE..........................................................................................17 Chapitre 1. Les plasmides................................................................................................................19 1.1. La réplication des plasmides..................................................................................................................21 1.1.1. La réplication de type !..................................................................................................................21 1.1.2. La réplication par déplacement de brin.........................................................................................23 1.1.3. La réplication par cercle roulant ou " rolling-circle »..................................................................25 1.2. La régulation de la réplication plasmidique..........................................................................................27 1.2.1. Le contrôle de la réplication par les ARN antisens......................................................................27 1.2.2. Contrôle de la réplication par les itérons.......................................................................................29 1.2.3. Réplication et incompatibilité........................................................................................................31 1.3. Les systèmes de maintien ou de stabilisation d'un plasmide...............................................................32 1.3.1. Résolution des multimères.............................................................................................................32 1.3.2. Les systèmes de partition...............................................................................................................35 1.3.3. Les systèmes toxine-antitoxine......................................................................................................46 1.3.4. Les systèmes de restriction-modification (RM)............................................................................62 1.4. Mobilité des plasmides...........................................................................................................................64 1.4.1. Classification des plasmides sur la base de leur mobilité............................................................64 1.4.2. Le complexe MOB ou relaxosome................................................................................................66 1.4.3. Le pilus conjugatif..........................................................................................................................69 1.4.4. Le système de sécrétion de type IV conjugatif.............................................................................71 1.4.5. Facteurs influençant le taux de transfert........................................................................................76 Chapitre 2. Les éléments génétiques mobiles................................................................................79 2.1. Les recombinaisons génétiques..............................................................................................................79 2.1.1. La recombinaison homologue........................................................................................................79 2.1.2. La transposition...............................................................................................................................81 2.1.3. La recombinaison spécifique de site..............................................................................................83 2.2. Les séquences d'insertion et transposons composites..........................................................................85 2.2.1. Structure et organisation.................................................................................................................85 2.2.2. Les principales séquences d'insertion...........................................................................................87 2.3. Les transposons unitaires........................................................................................................................91 2.3.1. Les transposons de la famille de Tn3............................................................................................91 2.3.2. Les transposons de la famille de Tn5053......................................................................................92 2.4. Les intégrons...........................................................................................................................................93 2.4.1. Structure des intégrons...................................................................................................................94 2.4.2. Les différents types de recombinaisons.........................................................................................95 2.4.3. Les intégrons de classe 1................................................................................................................96 2.5. Les ISCR................................................................................................................................................102 2.5.1. Les ISCR et la transposition en cercle roulant............................................................................104 2.5.2. L'ISCR1 et les intégrons de classe 1 complexes........................................................................106 2.6. Les eléments intégratifs conjugatifs....................................................................................................108 2.7. Intérêt de l'étude des éléments génétiques mobiles et des plasmides portant des gènes de résistance aux antibiotiques..............................................................................................................................................113 Chapitre 3. Les "-lactamases.........................................................................................................115 3.1. Classifications des "-lactamases..........................................................................................................115

Sommaire 8 3.1.1. La classification de Ambler.........................................................................................................115 3.1.2. La classification fonctionnelle de Bush et Jacoby......................................................................116 3.2. Les "-lactamases à spectre étendu (BLSE).........................................................................................119 3.2.1. Les BLSE de type TEM et SHV..................................................................................................119 3.2.2. Les BLSE de type CTX-M..........................................................................................................121 3.2.3. Les BLSE de classe A dites " mineures »...................................................................................125 3.2.4. Les BLSE de type OXA (Oxacillinases).....................................................................................126 3.3. Les cephaloporinases plasmidiques.....................................................................................................126 3.4. Les carbapénémases..............................................................................................................................127 3.4.1. Les carbapénémases de la classe A de Ambler...........................................................................128 3.4.2. Les carbapénémases de la classe D de Ambler...........................................................................129 3.4.3. Les métallo-"-lactamases............................................................................................................130 TRAVAUX ORIGINAUX..................................................................................................143 Objectifs................................................................................................................................................145 Résultats et discussion........................................................................................................................147 Transfert in vivo et environnement génétique de blaVIM-1.............................................................................147 La structure du plasmide pTC2.......................................................................................................................150 Les systèmes de réplication du plasmide pTC2.............................................................................................157 Le réplicon repA/C........................................................................................................................................158 Le réplicon repR...........................................................................................................................................161 Le système de transfert du plasmide pTC2....................................................................................................164 Les systèmes de maintien du plasmide pTC2.................................................................................................168 Les systèmes de partition de pTC2............................................................................................................169 3.4.4. Les systèmes de résolution des multimères................................................................................174 Les systèmes toxine-antitoxine de pTC2...................................................................................................176 La région de multirésistance du plasmide pTC2...........................................................................................179 Les intégrons de classe 1............................................................................................................................180 L'opéron mer de résistance au mercure.....................................................................................................184 Le module de résistance aux macrolides mph...........................................................................................186 3.4.5. Les transposons composites de pTC2..........................................................................................187 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.............................................................................191 PUBLICATIONS..............................................................................................................197 AUTRES PUBLICATIONS...............................................................................................211 REFERENCES.................................................................................................................267

Table des illustrations 9 TABLE DES ILLUSTRATIONS FIGURES Figure 1 : La réplication de type thêta.......................................................................................................................23 Figure 2 : Organisation et environnement génétique de l'origine de réplication du plasmide RSF1010.............24 Figure 3 : Initiation de la réplication par déplacement de brin du plasmide RSF1010.........................................24 Figure 4 : Modèle de réplication par cercle roulant.................................................................................................25 Figure 5 : Régulation de la réplication du plasmide ColE1.....................................................................................28 Figure 6 : Contrôle de la réplication du plasmide R1...............................................................................................29 Figure 7 : Mécanisme de régulation de la réplication par les itérons (handcuffing).............................................30 Figure 8 : Recombinaison au niveau des sites cer (ColE1) et psi (pSC101)...........................................................33 Figure 9 : Organisation génétique de la région de stabilité du plasmide RK2.......................................................34 Figure 10 : Organisation génétique du système Cre/loxP du plasmide P1.............................................................34 Figure 11 : Organisation génétique du système de partition de type Ia. Exemple du plasmide P1.......................37 Figure 12 : Modèle de déplacement de plasmide le long du nucléoïde bactérien...................................................38 Figure 13 : Organisation génétique du système de patition de type Ib du plasmide pB171..................................39 Figure 14 : Modèle de traction par un filament de ParA..........................................................................................40 Figure 15 : Organisation génétique du système de patition de type II du plasmide R1..........................................41 Figure 16 : Le système de partition parMRC du plasmide R1.................................................................................42 Figure 17 : Mécanisme de séparation de deux copies du plasmide R1....................................................................42 Figure 18 : Organisation génétique du système de partition de type III du plasmide pBtoxis...............................43 Figure 19 : Incompatibilité de partition.....................................................................................................................44 Figure 20 : Le modèle d'appariement hétérologue...................................................................................................45 Figure 21 : Le modèle du positionnement aléatoire des foyers de plasmides..........................................................45 Figure 22 : Transmission verticale d'un plasmide portant un système toxine-antitoxine......................................47 Figure 23 : Compétition entre un plasmide conjugatif porteur d'un système toxine-antitoxine PSK+ et un plasmide conjugatif qui n'est pas porteur d'un système toxine-antitoxine PSK- ...................................................48 Figure 24 : Le modèle d'anti-addiction......................................................................................................................51 Figure 25 : Système toxine-antitoxine de type I.........................................................................................................52 Figure 26 : Système toxine-antitoxine de type II........................................................................................................54 Figure 27 : Structure primaire et secondaire de l'ARNt initiateur de E. coli..........................................................57 Figure 28 : Système toxine-antitoxine de type III......................................................................................................59 Figure 29 : Constitution génétique du système de transfert et mécanisme de conjugaison chez les plasmides conjugatifs et les plasmides mobilisables...................................................................................................................65 Figure 30 : Structure du système de sécrétion de type IV (système VirB/VirD4) de A. tumefaciens.....................72

Table des illustrations 10 Figure 31 : Distribution des types de SST4 des plasmides isolés de Proteobacteria en fonction de la taille des plasmides en kilobases.................................................................................................................................................75 Figure 32 : Distribution des types de relaxase (MOB) au sein de chaque type de système de sécrétion de type IV (SST4)............................................................................................................................................................................76 Figure 33 : Les différents types de recombinaison homologue................................................................................81 Figure 34 : Les différents acteurs de la transposition...............................................................................................82 Figure 35 : Transposition conservative (ou non-réplicative) d'un élément transposable......................................82 Figure 36 : Transposition réplicative d'un élément transposable entre deux molécules d'ADN différentes........83 Figure 37 : Réarrangements pouvant être obtenus par recombinaison spécifique de site.....................................84 Figure 38 : Structure d'une séquence d'insertion (IS)..............................................................................................86 Figure 39 : Structure d'un transposon composite.....................................................................................................86 Figure 40 : Exemples de transposons composites.....................................................................................................87 Figure 41 : Structure de l'ISEcp1...............................................................................................................................91 Figure 42 : Organisation génétique des transposons de la famille de Tn3.............................................................92 Figure 43 : Organisation génétique des transposons de la famille de Tn5053.......................................................93 Figure 44 : Structure d'un intégron............................................................................................................................95 Figure 45 : Modèle de capture et d'excision de cassettes.........................................................................................96 Figure 46 : Représentations schématiques de la structure hybride apparentée au transposon Tn402 et d'un intégron de classe 1......................................................................................................................................................98 Figure 47 : Organisation du transposon Tn21..........................................................................................................99 Figure 48 : Comparaison des activités des variants du promoteur Pc et des combinaisons Pc-P2 par mesure de l'activité bêta-galactosidase des fusions Pc-lacZ....................................................................................................101 Figure 49 : Intégrons de classe 1 complexes In6 et In7..........................................................................................103 Figure 50: Représentation schématique d'une ISCR...............................................................................................104 Figure 51 : La transposition en cercle roulant........................................................................................................105 Figure 52 : Formation d'un intégron de classe 1 complexe...................................................................................106 Figure 53 : Modèle de construction des intégrons de classe 1 complexes.............................................................107 Figure 54 : Schéma du cycle d'un élément intégratif conjugatif (ICE)..................................................................109 Figure 55 : Images de synergie.................................................................................................................................119 Figure 56: Substitutions en acides aminés décrites chez les BLSE de type TEM..................................................120 Figure 57 : Substitutions en acides aminés décrites chez les BLSE de type SHV.................................................121 Figure 58 : Evolution de la proportion de souches de E. coli résistantes ou de sensibilité intermédiaire aux céphalosporines de 3ème génération..........................................................................................................................122 Figure 59 : Dendrogramme des enzymes de type CTX-M.......................................................................................124 Figure 60 : Répartition mondiale des différentes BLSE de type CTX-M...............................................................124 Figure 61 : Evolution du nombre d'épisodes de colonisation ou d'infection avec une EPC en France, 1er janvier 2004-Avril 2011..........................................................................................................................................................128 Figure 62 : Répartition géographique des enzymes de type KPC..........................................................................129 Figure 63 : Répartition géographique de l'enzyme OXA-48..................................................................................130 Figure 64 : Répartition géographique de l'enzyme NDM-1...................................................................................132

Table des illustrations 11 Figure 65 : Antibiogramme par méthode de diffusion sur milieu Muller-Hinton d'une souche de K. pneumoniae productrice de la MBL VIM-1...................................................................................................................................133 Figure 66 : Diversité allélique des enzymes de type VIM.......................................................................................134 Figure 67 : Répartition géographique des souches productrices d'enzymes de type VIM apparentées à VIM-1......................................................................................................................................................................................136 Figure 68 : Chronologie des prélèvements et des antibiothérapies.......................................................................148 Figure 69 : Intégrons de classe 1 portant le gène blaVIM-1 isolés chez le même patient........................................148 Figure 70 : Profils de restriction des plasmides obtenus avec les enzymes EcoRI, NdeI et SphI........................149 Figure 71 : Alignement du squelette IncA/C de pTC2 avec les plasmides du groupe IncA/C les plus proches..153 Figure 72 : Alignement du squelette de pTC2 avec celui des plasmides du groupe IncA/C les plus proches.....154 Figure 73 : Arbre phylogénique montrant les relations entre huit plasmides du groupe IncA/C........................155 Figure 74 : Alignement de la région IncR de pTC2 avec les régions correspondantes présentes sur les plasmides les plus proches..........................................................................................................................................................157 Figure 75 : Arbre phylogénétique des protéines RepA des plasmides du groupe d'incompatibilité IncA/C.......158 Figure 76 : Organisation génétique de la région de réplication du plasmide pTC2............................................159 Figure 77 : Région du réplicon repA/C contenant les itérons...................................................................................160 Figure 78 : Séquence nucléotidique des itérons situés en aval du gène repA sur le plasmide pTC2 et comparaison avec la séquence consensus des itérons du réplicon repA/C du plasmide pRA1...............................160 Figure 79 : Organisation fonctionnelle du réplicon rep! du plasmide pGSH500................................................162 Figure 80 : Séquence nucléotidique des itérons situés en aval du gène repB sur le plasmide pTC2 et comparaison avec la séquence consensus des itérons du réplicon rep! du plasmide pGSH500.........................163 Figure 81 : Variations des moyennes géométriques des populations bactériennes, de la souche réceptrice E. coli J53, de la souche donneuse P. stuartii et des transconjugants dans le tube digestif des souris gnotoxéniques..165 Figure 82 : Représentation schématique des régions de transfert Tra1 et Tra2 du plasmide pTC2...................166 Figure 83 : Comparaison des loci Tra1 des plasmides du groupes IncA/C..........................................................168 Figure 84 : Organisation génétique du locus parABIncA/C.......................................................................................169 Figure 85 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_374............................................................169 Figure 86 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_371............................................................170 Figure 87 : Organisation génétique et environnement du locus parABIncR............................................................171 Figure 88 : Recherche de domaines conservés sur la protéine ParAIncR (pTC2_53)............................................171 Figure 89 : Recherche de domaines conservés sur la protéine ParBIncR (pTC2_51)............................................171 Figure 90 : Alignement des séquences en acides aminés des protéines ParA du phage P1 et de la protéine ParAIncR du plasmide pTC2........................................................................................................................................172 Figure 91 : Alignement des séquences en acides aminés des protéines ParB du phage P1 et de la protéine ParBIncR du plasmide pTC2........................................................................................................................................172 Figure 92 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_512............................................................173 Figure 93 : Organisation génétique et environnement du locus kfr du plasmide pTC2.......................................173 Figure 94 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_161............................................................175 Figure 95 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_112............................................................175 Figure 96 : Organisation génétique du locus higBA-like........................................................................................176

Table des illustrations 12 Figure 97 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_423 ...........................................................177 Figure 98 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_425............................................................177 Figure 99 : Organisation génétique de l'opéron bicistronique vagCD-like..........................................................177 Figure 100 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_105..........................................................178 Figure 101 : Recherche de domaines conservés sur la protéine pTC2_104..........................................................178 Figure 102 : Organisation génétique de la région MDR du plasmide pTC2.........................................................180 Figure 103 : Comparaison des différents intégrons In-e541 présents dans la base de données GenBank.........181 Figure 104 : Comparaison des intégrons du plasmide pTC2 et du plasmide pNL194.........................................184 Figure 105 : Structure de l'opéron merpTC2..........................................................................................................185 Figure 106 : Module Mph de pTC2..........................................................................................................................186 Figure 107 : Tn4352 de pTC2 et son environnement génétique.............................................................................187 Figure 108 : Comparaison des transposons composites portant le gène blaSHV sur les plasmides pTC2 et pIP1202.......................................................................................................................................................................188 Figure 109 : Structure résumée du plasmide pTC2.................................................................................................193 TABLEAUX Tableau 1 : Systèmes toxine-antitoxine plasmidiques...............................................................................................60 Tableau 2 : Classification des relaxases-types des plasmides isolés chez les entérobactéries..............................68 Tableau 3 : Principales familles de séquences d'insertion.......................................................................................88 Tableau 4 : Caractéristiques des principales IS associées aux gènes de résistance aux antibiotiques.................89 Tableau 5 : Séquence et fréquence des variants des promoteurs Pc et P2 retrouvés dans les intégrons de classe 1...................................................................................................................................................................................100 Tableau 6 : Fréquence des différentes combinaisons Pc-P2 retrouvées dans les intégrons de classe 1.............101 Tableau 7 : ISCR associées à des gènes de résistance aux antibiotiques..............................................................103 Tableau 8 : Principaux éléments génétiques (hors plasmides et ICE) associés à la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif.............................................................................................................................110 Tableau 9 : Classification de Bush et Jacoby et correspondance avec la classification structurale de Ambler.118 Tableau 10 : Caractéristiques des plasmides portant un gène apparenté à blaVIM-1.............................................138 Tableau 11 : Structure et caractéristiques des intégrons de classe 1 associés aux MBL de type VIM................140 Tableau 12 : Caractéristiques des intégrons de classe 1 contenant le gène blaVIM-1............................................141 Tableau 13 : Plasmides conjugatifs du groupe IncA/C séquencés.........................................................................152 Tableau 14 : Evolution de la concentration moyenne de la souche réceptrice (E. coli J53), donneuse P. stuartii et des transconjugants dans les fèces des 5 souris...................................................................................................165 Tableau 15 : Séquence et organisation des promoteurs des intégrons de classe I du plasmide pTC2................182

Abréviations 13 ABREVIATIONS AA Acide aminé AC Acide clavulanique ADN Acide désoxyribonucléique ADN-T Acide désoxyribonucléique transféré ADP Adénosine diphosphate ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager ARNt Acide ribonucléique de transfert ATP Adénosine triphosphate BLSE "-lactamase à spectre étendu CLIN Comité de lutte contre les infections nosocomiales C1G Cephalosporine de 1ère génération C2G Cephalosporine de 2ème génération C3G Cephalosporine de 3ème génération C4G Cephalosporine de 4ème génération DR Direct Repeat ; séquence répétée directe EBLSE Entérobactérie productrice de "-lactamase à spectre étendu EDTA Acide éthylène diamine tétra-acétique EPC Entérobactérie productrice de carbapénémase ERG Entérocoque résistant aux glycopeptides GTP Guanosine triphosphate ICE Integrative conjugative element ; éléments intégratifs conjugatifs IR inverted repeat ; séquence inversée répétée IRR inverted repeat right ; séquence inversée répétée de droite IRL inverted repeat left ; séquence inversée répétée de gauche IS Insertion sequence ; séquence d'insertion ISCR Insertion sequence common region kb kilobase MBL Métallo-"-lactamase MDR Multi-Drug Resistance MPF Mating pair formation

Abréviations 14 ORF open reading frame ; cadre de lecture pb paires de base PBRT PCR based replicon typing pMLST plamid multi locus sequence typing pRNA Amorce d'ARN (primer RNA) PSK Post-segregational killing RM restriction modification SI superintégron SST4 système de sécretion de type IV ST Sequence-type STA Système toxine-antitoxine T4CP type IV coupling protein ; protéine de couplage TRI TEM résistant aux inhibiteurs TZB tazobactam

Introduction générale 15 INTRODUCTION GENERALE Depuis le début des années 2000, l 'incidence global e des entér obactéries productri ces de "-lactamases à spectre étendu (EBLSE) a augmenté dans de nombreux pays, au point que l'on parle désormais de pandémie de EBLSE. Cette s ituat ion constitue un problème de santé publique car ces bactéries sont non seulement résistantes à la plupart des "-lactamines, mais présentent souvent des résist ances associées à d'autres classes d'antibiotiques utilisés en thérapeutique humaine, en particulier aux fluoroquinolones, aux aminosides et à l'association sulfaméthoxazole-triméthoprime. Au cours de la dernière décennie, les s ouches d'entérobactéries productrices de carbapénémase (EPC ) ont également émergé et sont devenues endémiques dans certaines régions du globe. Les carbapénèmes comptant parmi les rares molécules encore actives en cas d'infection à EBLSE, la diffusion de souches capables de les hydrolyser est particulièrement préoccupante, car elle conduit à des situations d'échec thérapeutique. Les entér obactéries sont des bacilles à Gram négati f qui échangent régul ièrement des informations génétiques entre elles ou avec d'aut res bactéries prés entes dans leur environnement. Ces transferts de gènes peuvent aboutir à l'acquisition, par une bactérie donnée, de gènes de résistance aux antibiotiques, notamment grâce aux éléments génétiques mobiles qui constituent de véritables véhicules de la résistance. Ceux-ci jouent un grand rôle dans l'émergence et la diffusion de la résistance aux antibiotiques en capturant des gènes et en les transférant d'une molécule d'ADN à une autre, et d'une bactérie à une autre. Afin de mieux comprendre les mécanismes de l'émer gence de la résis tance et pour lutter plus efficacement contre les bactéries multirésistantes (BMR), nous devons donc tenir compte des interactions qui existent entre (a) les clones bactériens exprimant la multirésistance, (b) les gènes codant pour cette multirésistance et (c) les éléments génétiques qui portent ces gènes. Dans ce travail, dont le point de départ est un cas clinique impliquant un plasmide conjugatif codant notamment pour une carbapénémase et une BLSE, nous analyserons les mécanismes moléculaires impliqués dans le succès plasmidique et indirectement, dans le succès de la résistance aux antibiotiques.

Introduction générale 16

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

Partie bibliographique - Les plasmides 19 Chapitre 1. LES PLASMIDES Les plasmides sont des éléments génétiques extra-chromosomiques dont la réplication est autonome. Ces réplicons peuvent être transm is d'une cellule à une autre de manière horizontale et ne portent pas de gènes indispensables au fonctionnement de la cellule hôte. Les plasmides sont souvent porteurs de gènes qui confèrent un avantage sélectif et adaptatif à la bactérie hôte, comme la détoxif ication, la r ésistance aux antibioti ques, la virulence (Shigella sp., Bacillus anthracis...) et des fonctions écologiques. Les pl asmides sont des éléments génétiques ubiquitaires qui sont retrouvés dans la plupart des espèces bactériennes ; près de la moitié des plasmides publiés proviennent de protéobactéries (46%), en particulier des gammaproteobactéries (29%) [1]. Les plasmides ont été décrits dans des écosystèmes très différents, allant de l'évent hydrothermal (écosystème qui se forme le long des dors ales océaniques, lorsqu'une fissure à la surface de la Terre permet au magma et à la lave de s'infiltrer) [1 ,2] au sol arctique [3]. Plus de la moitié des plasmides publiés provenait d'un environnement animalier et un tiers provenait d'un environnement aquatique ou terrestre [4]. Pour les plasmides de plus de 100 kb, la tendance était différente, les plasmides provenant le plus souvent d'un environnement terrestre (65%) ou aquatique (27%). Bien qu'il existe des plasmides linéaires [5], la majorité des plasmides sont des molécules d'ADN circulaires qui sont généralement plus petites que les chromosomes bactériens. En réalité la gamme de taille des plasmides est très large. Le plus petit plasmide référencé dans GenBank est le plasmide RKU1 de Thermotoga petrophila (846 paires de bases) et qui porte uniquement le gène rep [6]. Smillie et coll. ont étudié la base de données de GenBank et ont retrouvé 22 plasmides de très grande taille qui portent plus de 500 gènes, le plus grand, étant le plasmide pGMI1000MP de 2,09 Mpb décrit chez Ralstonia solanacearum GMI100 [7]. Ce mégaplasmide était plus grand que 20% des chromosomes bactériens publiés et portait 1674 gènes. Il existe une relation entre la taille du plasmide, la taille du génome et la densité de régions codantes. Les plasmides les plus grands sont hébergés par des procaryotes qui ont de grands chromosomes. Des analyses statistiques ont montré qu'il existait une corrélation entre la taille du plasmide et la pression écologique à laquelle est soumise la bactérie-hôte. Ainsi, plus un plasmide est grand et plus sa présence est indispensable à la survie de la bactérie-hôte dans son environnement naturel [4]. La densité de régions codantes est quant à elle plus importante pour les chromosomes que pour les plasmides (86% vs 75%), et plus importante

Partie bibliographique - Les plasmides 20 pour les grands plasmides (densité approchant celle des chromosomes) que pour les petits plasmides [1]. Les cellules hébergeant des plasmides peuvent être plus ou moins dépendantes de ces derniers en ter mes de survie. En effet , l es plasmides ne portent génér alement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule-hôte, cependant, il existe des plasm ides " obligatoires » qui ont longtemps été considérés comme des chromosomes secondaires et qui sont présents dan s environ une espèce bactérienne sur dix. Parmi ces espèces, on t rouve notamment celles qui appartiennent aux genres Agrobacterium, Brucella, Rhizobium, Ochrobactrum, Burkholderia, Ralstonia, Vibrio et Leptospira. Harris on et coll. ont récemment introduit la notion de chromide, élément génétique se distinguant du chromosome et du plasmide et qui est habituellement plus grand que les plasmides présents dans la cellule et plus petit que le chromosome. Le chromide est un réplicon dont la composition en guanine et cytosi ne est proche de celle du chromosome, qui a des sys tèmes de per sistance et de réplication de type plasmidique et qui porte des gènes essentiels à la croissance bactérienne, qui sont portés par le chromosome dans d'autres espèces bactériennes [8].

Partie bibliographique - Les plasmides 21 1.1. LA REPLICATION DES PLASMIDES Les plasmides sont des éléments génétiques mobiles qui sont capables de se répliquer pour se maintenir dans une population bactérienne. La réplication se déroule généralement selon une des stratégies suivantes : la réplication de type !, la réplication par déplacement de brin ou la réplication par cercle roulant ou " rolling-circle ». Bien qu'il utilise la machinerie cellulaire de la bactérie pour se répliquer, le plasmide porte à la fois une origine de réplication et certains facteurs de réplication. Par ailleurs, le nombre de copies du plasmide est régulé par le plasmide lui-même, indépendamment du chromosome. La présence d'un nombre élevé de copies d'un même plasmide joue un rôle dans la stabilité de ce dernier en assurant sa distribution dans chaque cellule-fille après la division cellulaire. 1.1.1. La réplication de type ! La réplication de type ! est un mécanisme souvent utilisé par les plasmides des bactéries à Gram négatif. C e mécanisme nécessite la séparation des deux brins d'ADN parents, l a synthèse d'une amorce d'ARN (primer RNA, pRNA) et une initiation de la synthèse d'ADN par l'extension du pRNA. La synthèse d'ADN peut se faire à partir d'un ou de plusieurs sites d'origines, de manière continue sur l' un des deux brins (brin pr écoce) et de manière discontinue sur l'autre brin (brin tardif). 1.1.1.1. L'origine de réplication L'origine de réplication (site ori) est l e plus petit fragment d 'ADN capable d'init ier la réplication quand la protéine initiatrice de la réplication est apportée en cis ou trans [9]. Cette zone prés ente sur le plasmi de (en cis) est indispensable à la répl ication autonome du plasmide. C'est à cet endroit que les deux brins d'ADN se séparent pour initier le processus de réplication et que la synthèse du brin précoce débute. Le site ori contient le plus souvent des séquences spécifiquement reconnues par la protéine initiatrice plasmidique Rep, une zone riche en adénine et thymine et un ou plusieurs sites de fixation de la protéine ini tiat rice de l 'hôte DnaA (boîtes dnaA ou dnaA boxes) . Dans de

Partie bibliographique - Les plasmides 22 nombreux plasmides, le site ori contient des séquences répétées directes, appelées itérons, qui sont des sites de fixation de la protéine plasmidique Rep et qui peuvent jouer un rôle dans le contrôle de la réplication. Ces itérons sont généralement disposés en tandem, séparés les uns des autres par une distance qui est généralement un multiple de 11 pb, ce qui correspond approximativement à un tour d'hélice de la double hélice d'ADN. Cet espacement permet aux protéines Rep fixées aux itérons d'être alignées sur une seule face de la molécule d'ADN. En général, pour un même site ori, les séquences des différents itérons ne sont pas identiques, mais présentent un mot if consensus comprenant un hexanucléot ide cons ervé (TCAGPuG) [10] et seuls quelques-uns de ces itér ons sont indis pensables au processus de répli cation [11,12]. Il exi ste cependant des pla smides à réplicat ion de type ! dont les origi nes de réplication sont dépourvues d'itérons, comme c'est le cas pour les plasmides R1 et ColE1. Par ailleurs, certains plasmides à répl ication par déplacement de br in ou par cercle roulant possèdent eux aussi des itérons. 1.1.1.2. Initiation et élongation des réplicons Pour la plupart des plasmides à réplication de type !, l'étape d'initiation nécessite au moins la présence de la protéine initiatrice d'origine plasmidique Rep et de la protéine initiatrice de l'hôte DnaA. Les protéi nes Rep r econnaissent des s ites de fixation spécif iques du site d'origine et forment un compl exe nucléo-protéique d'initiation [13]. Les com plexes s'associent à la protéine DnaA de l'hôte pour faciliter la séparation des deux brins d'ADN au niveau des zones riches en AT. Le complexe d'initiation permet également le recrutement séquentiel des composants du réplisome dont la principale hélicase, DnaB, catalyse le desenroulement des brins d'ADN. La deuxième étape est la synthèse d'une amorce ARN - pRNA - par l'ARN polymérase ou par des primases d'origine plasmidique ou chromosomique. L'ADN polymérase III de l'hôte va ensui te permettre l'él ongation du nouveau brin par extension des amorces ARN. La synthèse d'ADN se fait de manière continue sur l'un des deux brins (brin précoce) et de manière discontinue sur l'autre brin (brin tardif). Dans la majorité des cas, la réplication de type ! se fait de m anière bidirectionnelle mais asymétrique (Figure 1.2). En effet, ce mécanisme fait appel à deux fourches de réplication, mais l'une d'elles est arrêtée à moins de 1kb de l'origine de réplication, alors que la seconde réplique la quasi-totalité du plasmide (Figure 1.2). La réplication se termine lorsque la fourche la plus active arrive au niveau de la

Partie bibliographique - Les plasmides 23 seconde [14]. Les " plasmides-frères » sont ensuite décaténés à l'aide de la topoisomérase IV de l'hôte. Figure 1 : La réplication de type thêta. Les sphères grises représentent les fourches de réplication. Les rectangles noirs représentent les origines de réplication. Les flèches indiquent le sens de déplacement des fourches de réplication. Les nouveaux brins sont représ entés en r ouge. 1. Répl ication de type thêta bidirectionnelle symétrique. 2. Répl ication de type thêta bidirectionnelle asym étrique. 3. Réplication de type thêta unidirectionnelle. 1.1.2. La réplication par déplacement de brin Le plasmi de RSF1010, plasmide mobili sable à l arge s pectre d'hôte du groupe d'incompatibilité IncQ, est l'exemple le plus connu de réplicon utilisant la réplication par déplacement de brin. Cett e r éplication peut être uni- ou bi direct ionnelle. Le plasmide RSF1010 code pour l'hélicase RepA, pour la primase RepB' et pour la protéine initiatrice de la réplication RepC. L'origine de réplication oriV de RSF1010 comprend (i) trois itérons identiques de 20 pb et la moitié d'un quatrième itéron, (ii) deux régions adjacentes de 28 et 37 pb qui sont respectivement très riches en GC et AT et (iii) deux séquences répétées inversées qui comprennent les sites ssiA et ssiB qui sont des séquences adjacentes et symétriques qui se font face, chacune sur un brin d'ADN (Figure 2 et Figure 3.1).

Partie bibliographique - Les plasmides 24 Figure 2 : Organisati on et environnement génétique de l' origine de réplication du plasmide RSF1010. D'après del Solar et coll. [15]. Les rectangles contenant une flèche correspondent aux itérons, site de fixation de la protéine initiatrice de la réplication RepC. Les flèches orientées en sens opposés représentent les séquences inversées répétées sur lesquelles se fixe RepB'. Les itérons sont les sites de fixation de la protéine initiatrice de la réplication RepC (Figure 3.2). La protéine RepA, qui possède une activité ATPasique dépendante de l'ADN simple brin ainsi qu'une activité hélicase, se fixe sur la région riche en AT du site d'origine (Figure 3.3) et interagit avec le dimère de RepC pour séparer les deux brins d'ADN, ce qui conduit à l'exposition des sites ssi sous la forme simple brin (Figure 3.4). La primase RepB' se fixe alors spécifiquement sur les sites ssi et catalyse l'amorçage de la synthèse d'ADN sur chacun des brins de façon indépendante (Figure 3.5). La synthèse d'ADN est ensuite poursuivie par l'ADN polymérase III de l'hôte et se fait de façon continue sur les deux brins d'ADN, mais pas forcément de façon synchrone (Figure 3.6). Figure 3 : Initiation de la réplication par déplacement de brin du plasmide RSF1010. D'après Del Solar et coll. [15] Protéine initiatrice Hélicase

Partie bibliographique - Les plasmides 25 1.1.3. La réplication par cercle roulant ou " rolling-circle » Le mécanisme de réplication plasmidique par cercle roulant est ubiquitaire chez les bactéries à Gram positif, mais a également été décrit chez de nombreuses bactéries à Gram négatif [16-19]. En général, les plasmides utilisant ce mode de réplication sont petits (<10 kb) et présents en de multiples copies au sein d'une même cellule. L'étude des plasmides de la famille de pT181 a permis à Kahn de proposer le modèle décrit ci-dessous [20] (Figure 4). Figure 4 : Modèle de réplication par cercle roulant. D'après Kahn [20] 1.1.3.1. Initiation de la réplication et élongation du brin tardif L'initiation de cette réplication nécessite une protéine initiatrice d'origine plasmidique Rep sous forme de dimère, et un site d'origine de réplication double brin (double strand origin of replication, dso) (Figure 4.1). Ce site dso contient à la fois le site de fixation et le site de restriction nick de la protéine Rep [21,22]. La liaison de Rep sur le site d'origine conduit à une courbure de l'ADN et/ou à la formation d'une épingle à cheveux ou d'une croix, sur laquelle se trouve le site nick de Rep sous forme simple brin (Figure 4.2). Le dimère Rep coupe alors le brin d'ADN au niveau de nick et reste lié de façon covalente à l'extrémité 5' libre du site de coupure par le biais d'un résidu de tyrosine présent dans le site actif de sa sous-unité A (sous-unité bleue sur le schéma) (Figure 4.3). Rep recrute alors une hélicase de l'hôte, PcrA chez les bactéries à Gram positif, qui désenroule l'ADN. L'ADN simple brin ainsi déplacé est lié à une protéine fixant l'ADN simple brin (single strand binding protein,

Partie bibliographique - Les plasmides 26 SSB) de l'hôte (Figure 4.4). En parallèle, la réplication du brin précoce débute à l'extrémité 3' libre du site de coupure à l'aide de l'ADN polymérase III de l'hôte (Figure 4.4). 1.1.3.2. Terminaison de la réplication du brin précoce La réplication du brin précoce l'ADN polymérase III de l'hôte se poursuit jusqu'à ce que le brin précoce ait été complètement déplacé et que la fourche de réplication ait atteint le site de terminaison qui est représenté par le dso reconstitué [22] (Figure 4.4). L'ADN polymérase dépasse d'une dizaine de nucléotides la jonction entre le brin déplacé et le nouveau brin, ce qui déplace cette jonction. Cette dernière, qui correspond au site de coupure de Rep, se trouve alors sous forme simple brin et peut être coupée par la sous-unité B de Rep, restée libre (sous-unité noire sur le schéma) (Figure 4.4). Par une réaction de transestérification, l'extrémité 3' libérée du brin déplacé attaque la liaison nucléo-protéique formée par l'extrémité 5' du même brin et la sous-unité A de Rep. Cette réaction permet de libérer un ADN simple brin circulaire qui correspond au brin parental déplacé, en laissant la protéine Rep attachée à l'extrémité 5' du bri n natif par l e biais d'une liaison covalente avec sa sou s-unité B (sous-unité noire) (Figure 4.5). L'extrémité 3' du brin natif est à son tour déplacée par le nouveau complexe Rep-ADN, ce qui permet à la sous-unité A de Rep (sous-unité bleue) de cliver ce brin au niveau du sit e nick. Une nouvell e réaction de transestérifi cation permet de libé rer et de circulariser le brin natif d'ADN (Figure 4.6). La protéine Rep est elle aussi libérée, mais reste liée à l'oligonucléotide d'une dizaine de bases, ce qui la rend inactive pour les prochaines réplications [23] (Figure 4.6). L' ADN double brin, constitué d'un brin parental et du brin natif, est sous forme circulaire et relâchée ; il est ensuite surenroulé par l'ADN gyrase de l'hôte. 1.1.3.3. Réplication du brin tardif Le brin parental qui a été déplacé lors de la synthèse du nouveau brin d'ADN est à son tour répliqué, à l'aide d'un site d'origine simple brin (single strand origin of replication, sso) qui est généralement situé en amont du dso, et à l'aide de protéines de l'hôte [24,25] (Figure 4.7). Cette étape fait appel à la synthèse d'une amorce d'ARN de 20 à 45 nucléotides par l'ARN polymérase [26-28], à l'ext ension de cette amorce par l'ADN polymérase I puis à une élongation par l'ADN polymérase III. Les deux extrémités de cette copie sont alors reliées par la ligase et le nouveau plasmide double brin est surenroulé par l'ADN gyrase.

Partie bibliographique - Les plasmides 27 1.2. LA REGULATION DE LA REPLICATION PLASMIDIQUE Le nombre de copies d'un même plasmide dans une cellule bactérienne dépend du plasmide lui-même, de l'hôte qui l'héberge et des conditions de croissance de l'hôte. En général, les plasmides sont maintenus à une concentration fixe dans une population bactérienne, ce qui implique que des systèmes régulateurs ajustent la fréquence de réplication à une moyenne d'une réplication par copie plasmidique et par cycle cellulaire. Ces systèmes de régulation de la réplicat ion peuvent également être à l'ori gine d'une augment ation de la fréquence d e réplication lorsque le nombre de copies plasmidiques est trop faible. 1.2.1. Le contrôle de la réplication par les ARN antisens Les ARN antisens, ou " countertranscribed RNAs » (ctRNAs), sont des molécules d'ARN complémentaires d'une région 5' d'un transcrit cible essentiel à l'initiation de la réplication, comme c'est le cas de l'amorce d'ARN (pRNA) et de l'ARN messager du gène rep. Le plus souvent, ce système de régulation concerne les plasmides à grand nombre de copies, comme les plasmides ColE1 et p15A, mais il peut également être impliqué dans la régulation de plasmides à faible nombre de copies, comme c'est le cas du plasmide R1. 1.2.1.1. Le modèle du plasmide ColE1 Le plasmi de ColE1 est un petit plas mide à réplication de type ! dont la réplicat ion ne nécessite pas la présence d'une protéine initiatrice d'origine plasmidique. L'initiation de la réplication fait appel à l'ARN pol ymérase qui synthétis e une amorce d' ARN de 550 pb appelée ARN II (Figure 5). Cette amorce ARN subit ensuite une étape de maturation par la RNAse H qui génère sur ce pRNA une extrém ité 3'-OH à par tir de laquelle l'ADN polymérase I débute la synthèse d'ADN. Le processus de maturation de l'ARN II est donc une étape essentielle à l'initiation de la réplication. Cette étape peut être inhibée par liaison d'un ARN complémentaire de 108 nucléotides, l'ARN I, sur l'ARN II (Figure 5). En se liant à la région 5' de l'ARN II, l'ARN I inhibe la maturation de ce dernier, ce qui conduit au blocage de l'initiation de la réplication plasmidique.

Partie bibliographique - Les plasmides 28 L'ARN I est un ARN instable dont la demi-vie est courte (1 minute) et qui est transcrit de manière constitutive. La régulation de sa production ne se fait donc pas au nivea u transcriptionnel, mais essentiellement au niveau post-transcriptionnel, par un processus de dégradation qui fait intervenir des facteurs cellulaires [29]. Figure 5 : Régulation de la réplication du plasmide ColE1. D'après Klumpp [30]. 1.2.1.2. Le modèle du plasmide R1 Le plasmi de R1 est un plasmide à faible nom bre de copies (4 à 5 copies par cellule à croissance rapide). La régulation de la réplication de ce plasmide fait intervenir les gènes copB et copA dont les produits inhibent l'expression du gène repA qui code pour la protéine initiatrice de la réplication. Cette inhi bit ion d'express ion se fait au ni veau post-transcriptionnel pour l'ARN antisens CopA et au niveau transcriptionnel pour la protéine CopB (Figure 6). L'ensemble de ces mécanismes de régulation permet d'ajuster finement la fréquence d'initiation de la réplication du plasmide R1 [31]. Les gènes copB et copA se trouvent en amont du gène repA et la transcription de ce dernier peut se fai re à parti r de deux promoteurs PcopB et PrepA dif férents qui sont localisés respectivement en amont et en aval de copB (Figure 6). La transcription à partir de PcopB conduit à la producti on d'un ARNm polyci stronique CopB-CopT-RepA, alors que l a transcription à partir de PrepA conduit à la production d'un ARNm CopT-RepA. La régulation faisant intervenir le gène copA intervient au niveau post-transcriptionnel en inhibant la traduction de RepA. Le transcrit de copA est un ARN antisens qui se fixe à la

Partie bibliographique - Les plasmides 29 région leader copT de l'ARNm de repA pour former un complexe d'ARN copA-copT qui est clivé par la RNAse III (Figure 6). Ce clivage conduit à une diminution de l'expression de RepA et à une inhibition de l'initiation de la réplication [32,33]. La régulation de la réplication de R1 fait également appel à la protéine CopB, répresseur transcriptionnel qui réprime le promoteur PrepA de repA. L'ARNm est alors principalement produit sous la forme d'un ARNm polycistronique CopB-CopT-RepA à partir du promoteur PcopB (Figure 6.1). Au moment de l'installation du plasm ide dans la cellule-hôte (faibl e nombre de copies) ou lorsque le nombre de copies plasmidiques diminue, la concentration de CopB dans la cellule diminue et la régulation par CopB devient inefficace, ce qui conduit à une dérépression du promoteur PrepA (Figure 6.2). Il y a alors augmentation transitoire de la transcription de repA qui se traduit par une augmentation de la fréquence de réplication du plasmide [34]. Figure 6 : Contrôle de la réplication du plasmide R1. Adapté d'après de la Cueva-Méndez et Pimentel [35]. Les lignes ondulées représentent les ARNm et les f lèches indiquent l'orientation des ARNm. Le si te oriR1 est l'origine de réplication du plasmide R1. 1.2.2. Contrôle de la réplication par les itérons Certains plasmides ont une réplication régulée par des itérons. Ces plasmides possèdent une origine de réplication qui comprend notamment des séquences répétées de environ 20 pb appelées itérons et un gène adjacent qui code pour une protéine initiatrice de la réplication, habituellement appelée Rep. Les itérons, qui sont la cible des protéines initiatrices Rep, jouent un rôle dans l'initiation de la réplication, mais jouent également un rôle dans la régulation de la réplicat ion. Un modèle de régulation négative de la répli cation plasmidique par

Partie bibliographique - Les plasmides 30 " menottage » ou " handcuffing » a été proposé (Figure 7). Ce modèle repose sur l'interaction entre les protéines Rep fixées aux itérons d'une origine de réplication avec des complexes nucléo-protéiques similaires présents sur un plasmide voisin [36]. Ainsi, deux plasmides se trouvent appariés par leur s origines de répl ication via une interaction Rep-Rep, ce qui provoque un encombrement stérique et bloque la réplication. Ce phénomène peut également apparaître entre des itérons présents sur une même molécule d'ADN, à des endroits différents. Certains plasmides possèdent des itérons supplémentaires qui sont regroupés en dehors du site d'origine, dans un locus inc (incC pour le plasmide F et incA pour le plasmide P1) [10]. Un appariement peut donc avoir lieu entre les itérons du site d'origine et les itérons du site inc du même plasmide, ce qui conduit également à une inhibition de la réplication. Figure 7 : Mécanisme de régulation de la réplication par les itérons (handcuffing) A. Lorsque la concentration intracellulaire de la protéine initiatrice de la réplication Rep est faible, les monomères de Rep (en bleu) se fixent sur les itérons (flèches noires) de l'origine de réplication (en rose), ce qui active la réplication. B. Lorsque la concentration en protéine Rep augmente, il y formation de dimères de Rep (en violet). Cette forme inhibe la réplication en appariant deux plasmides (en pointillés) par le biais de leurs origi nes de réplication. C'est le mécanisme de " menottage » ou " handcuffing ».

Partie bibliographique - Les plasmides 31 1.2.3. Réplication et incompatibilité Selon la définition de Novick et coll., l'incompatibilité est l'incapacité pour deux plasmides différents de co-exister de façon stable dans la même cellule-hôte, en l'absence de pression de sélection continue [37]. Ce phénomène est la manifest ation d'une parenté ent re deux plasmides [38,39]. Ainsi, un plasmide entrant et un plas mide résident qui ont un ancêtre commun tendent à se séparer l'un de l'autre au fil des générations, ce qui conduit à des lignées cellulaires ne contenant qu'un seul des deux plasmides concernés. Ces deux plasmides sont alors dits " incompatibles ». L'incompatibilité peut être observée si deux plasmides hébergés par une même cellule ont des séquences identiques pour les régions impliquées dans la réplication. Ces deux plasmides, qui sont isologues, ne peuvent donc pas être distingués l'un de l'autre, ni par le mécanisme de sélection pour la réplication, ni par le système de contrôle de réplication. Ainsi, la sélection aléatoire de copies plasmidiques pour l'étape de réplication génère une inégalité entre les deux plasmides. Cette inégalité ne sera pas compensée et sera au contraire amplifiée à chaque étape de réplication. En effet, l'un des plasmides prend un avantage numérique sur l'autre et a une plus grande probabilité d'être sélectionné au sein du pool de plasmides pour la réplication suivante. Ce phénomène conduit ainsi , à un t aux constant , à des lignées cellulaires ne contenant qu'un seul des deux plasmides [37,40]. L'étude des plasmides ColE1 et pT181 a permis de mettre en évi dence un phénomène d'incompatibilité liée au contrôle de la réplication par les ARN antisens. Deux plasmides qui utilisent ce mode de contrôle et qui sont isogéniques pour la région codant pour ces ARN antisens, sont toujours incompatibles, qu'ils aient d'autres régions communes ou non [41,42]. D'autres plasmides, comme le plasmide F, dont le mécanisme de régulation de la réplication fait appel aux itérons, expriment une incompatibilité liée aux itérons qui est proportionnelle au nombr e d'itérons prés ents [43,44]. Enfin, un phénomène d'incompatibilité peut être observé quand deux plasmides possèdent des origines de réplication isologues, comme c'est le cas pour les plasmides ayant des itérons ainsi que pour le plasmide à régulation par les ARN antisens pT181 [44-46].

Partie bibliographique - Les plasmides 32 1.3. LES SYSTEMES DE MAINTIEN OU DE STABILISquotesdbs_dbs31.pdfusesText_37