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Il est rappelé que: Dans un délai de neuf mois à compter de la publication de la mention de la délivrance du brevet

européen au Bulletin européen des brevets, toute personne peut faire opposition à ce brevet auprès de l"Office européen

des brevets, conformément au règlement d"exécution. L"opposition n"est réputée formée qu"après le paiement de la taxe

d"opposition. (Art. 99(1) Convention sur le brevet européen).

Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR)

(19)

EP 2 710 131B1

(Cont. page suivante)TEPZZ 7_Z_¥_B_T (11)EP2 710 131B1 (12)FASCICULE DE BREVET EUROPEEN (45)Dat e de publication et mention de la délivrance du brevet:

27.02.2019Bulletin201 9/09

(21)Num éro de dépôt: 12722715.5 (22)Dat e de dépôt: 18.05.2012(51)Int C l.:

C12P5 /00

(2006.01)

C12P5/ 02

(2006.01)

C12N1/ 12

(2006.01)(86)Num éro de dépôt international:

PCT/EP2012/059230

(87)Num éro de publication internationale:

WO2012/ 159979 (29.11.2012Gazette2012/48)

(54) PROCEDE DE PREPARATION ET D"EXTRACTION DU SQUALENE A PARTIR DE MICROALGUES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG UND EXTRACTION VON SQUALEN AUS MIKROALGEN METHOD OF PREPARATION AND EXTRACTION OF SQUALENE FROM MICROALGAE (84)Etat s contractants désignés:

AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB

GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO

PL PT RO RS SE SI SK SM TR

(30)Pr iorité:20.05.2011CN 2011 10147052 (43)Dat e de publication de la demande:

26.03.2014Bulletin201 4/13

(73)Titu laire: Roquette Frères

62136 Lestrem (FR)

(72)Inv enteurs:

• PORA, Bernard

Dongfeng Sunshine City

Wuhan (Economic Develpt Area) 430056 (CN)

• QIAN, Yun

Wuhan 430056 (CN)

• CAULIER, Bernard

F-59273 Fretin (FR)

• COMINI, Serge

F-59253 La Gorgue (FR)

• LOOTEN, Philippe

F-59160 Lomme (FR)

• SEGUEILHA, Laurent

F-59350 St Andre Lez Lille (FR)

(74)Man dataire: Cabinet Plasseraud

66, rue de la Chaussée d"Antin

75440 Paris Cedex 09 (FR)

(56)D ocuments cités:

WO-A1-2007/039149WO-A2-2010/023551

US-A- 5 130 242US-B1- 6 248 779• CHEN G ET AL: "Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrid Aurantiochytrium sp", NEW

BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 27, no.

4, 30 septembre 2010 (2010-09-30), pages

382-389, XP027171921, ISSN: 1871-6784 [extrait

le 2010-04-20]

• KING WAI FAN ET AL: "Enhanced production of

squalene in the thraustochytrid

Aurantiochytrium mangrovei by medium

optimization and treatment with terbinafine",

WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND

BIOTECHNOLOGY, KLUWER ACADEMIC

PUBLISHERS, DO, vol. 26, no. 7, 8 janvier 2010

(2010-01-08), pages 1303-1309, XP019832729,

ISSN: 1573-0972

• YUE C J ET AL: "Impact of methyl jasmonate on squalene biosynthesis in microalga

Schizochytrium mangrovei", PROCESS

BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, NL, vol. 44, no. 8, 1

août 2009 (2009-08-01), pages 923-927,

XP026160671, ISSN: 1359-5113, DOI:

10.1016/J.PROCBIO.2009.03.016 [extrait le

2009-04-05]

• KAYA KUNIMITSU ET AL: "Thraustochytrid

Aurantiochytrium sp 18W-13a Accummulates

High Amounts of Squalene", BIOSCIENCE

BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 75,

no. 11, novembre 2011 (2011-11), pages

2246-2248, XP002678626,

2

EP2 710 131B1

• NAKAZAWA ATSUSHI ET AL: "Optimization of

culture conditions of the thraustochytrid

Aurantiochytrium sp. strain 18W-13a for

squalene production", BIORESOURCE

TECHNOLOGY, vol. 109, avril 2012 (2012-04),

pages 287-291, XP002678627, • LU-JING REN ET AL: "Development of a stepwise aeration control strategy for efficient docosahexaenoic acid production by

Schizochytrium sp", APPLIED MICROBIOLOGY

AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER, BERLIN,

DE, vol. 87, no. 5, 6 May 2010 (2010-05-06), pages

1649-1656, XP019841637, ISSN: 1432-0614• LEWIS ET AL.: MAR. BIOTECHNOL., 2001, pages

439-447,

• JIANG ET AL.: J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 52,

2004, pages 1196-1200,

EP2 710 131B1

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Description

[0001]La présente invention se rapporte à un procédé de production optimisée de squalène par voie fermentaire à

partir de microalgues de la famille des Thraustochytriales sp.

[0002]On entend au sens de l"invention par "microalgues de la famille des Thraustochytriales sp.» des microalgues

appartenant aux espèces Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp. et Thraustochytrium sp.

[0003]Le squalène est un triterpène, isoprénoide à trente atomes de carbone et cinquante atomes d"hydrogène, de

formule: 2,6, 10,15,19,23-Hexaméthyl-2,6,10,14,18,22-tétracosahexène.

[0004]C"est un lipide naturellement produit par tous les organismes supérieurs y compris chez l"Homme (retrouvé

dans le sébum). Le squalène est en effet un intermédiaire essentiel dans la biosynthèse du cholestérol, des hormones

stéroïdes et de la vitamine D (une enzyme des voies métaboliques du cholestérol, la squalène monooxygenase, en

oxydant l"une des extrémités de la molécule de squalène, va induire sa cyclisation et conduire au lanostérol, lequel sera

transformé en cholestérol et en autres stéroïdes).

[0005]En industrie, le squalène est surtout utilisé dans les domaines alimentaire, cosmétique et pharmaceutique.

[0006]Comme complément alimentaire, le squalène est habituellement formulé en capsules ou en huiles.

[0007]Dans le domaine cosmétique, cette molécule peut être utilisée comme antioxydant, antistatique et émollient

dans les crèmes hydratantes, pénétrant rapidement la peau sans laisser de traces ou de sensations grasses, et se

mélangeant bien avec d"autres huiles et vitamines.

[0008]Dans ce domaine, notons qu"étant donné la très grande instabilité du squalène (6 insaturations), c"est la forme

saturée squalane (obtenue par hydrogénation), meilleur anti-oxydant que le squalène, que l"on trouve sur le marché, et

à niveau de pureté en général très élevé (99%).

[0009]Les études toxicologiques ont montré qu"aux concentrations utilisées dans les cosmétiques, le squalène et le

squalane ne présentent pas de toxicité, et ne sont pas irritants ou sensibilisants pour la peau humaine.

[0010]Dans le domaine pharmaceutique, le squalène est utilisé comme adjuvants aux vaccins.

[0011]Ces adjuvants sont des substances qui stimulent le système immunitaire et augmentent la réponse au vaccin.

[0012]Sous la forme d"une émulsion ajoutée à la substance vaccinante pour rendre le vaccin plus immunogène, du

squalène est utilisé depuis 1997 dans un vaccin antigrippal (FLUAD, de la société CHIRON, contre la grippe saisonnière)

à raison d"environ 10 mg de squalène par dose. [0013]Comme tous les vaccins contenant du squalène, ces émulsions ont un aspect blanc laiteux.

[0014]Le squalène est également utilisé comme adjuvant vaccinal, notamment des vaccins expérimentaux, substan-

ces antipaludéennes ou vaccin antigrippe ciblant les virus émergents H5N1 puis en 2009 H1N1, en tant que:

-constituant breveté du système adjuvant AS03 utilisé par la société GLAXOSMITHKLINE dans le vaccin contre la

pandémie grippale 2009 Pandemrix et Arepanrix, -constituant breveté du système adjuvant MF59 utilisé par la société NOVARTIS.

[0015]Le squalène a été également ajouté aux vaccins antigrippaux pour stimuler la réponse immunitaire du corps

humain à travers la production de cellules CD4 à mémoire.

[0016]C"est le premier adjuvant huile-dans-l"eau pour vaccin contre la grippe à avoir été commercialisé en association

avec les antigènes du virus de la grippe saisonnière. [0017]Le niveau de pureté du squalène est essentiel dans ce domaine d"applications.

[0018]En effet, s"il est pris par voie orale, le squalène est considéré comme totalement sûr; mais c"est la voie injectable

qui fait l"objet de controverses.

[0019]En effet, dans le domaine médical, le risque de préjudice pour un receveur humain peut être accru dans les

situations où le squalène est contaminé par des impuretés, car par définition, cet adjuvant peut induire une forte réponse

immunitaire également contre ses propres impuretés.

[0020]Il est donc indispensable de disposer de squalène de haute qualité, exempt d"impuretés (traces de métaux,

notamment de mercure, et d"autres toxines).

[0021]Un certain nombre de voies de production du squalène sont proposées dans la littérature.

[0022]C"est un composé que l"on trouve souvent stocké dans le foie des poissons cartilagineux tels que les requins

des profondeurs (d"où son nom).

[0023]Il est donc une des causes de leur surpêche, le requin étant déjà chassé pour ses ailerons. Les foies de requin

sont ainsi désormais vendus pour produire des gélules qualifiées de "bonnes pour la santé".

[0024]Cependant, si le squalène commercialisé est ainsi principalement extrait de foies de requins, il n"est pas exempt

de problème sanitaire.

[0025]En effet, les requins peuvent être infectés par des pathogènes pouvant produire des substances nuisibles pour

l"homme. En outre, le foie des requins, organe d"élimination et de purification de l"organisme, peut contenir des toxines

telles que la carchatoxine qui est néfaste pour l"homme.

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[0026]Ces préoccupations environnementales (forte régression des requins) et sanitaires (le foie des poissons stocke

aussi des toxines préoccupantes pour la santé) ont motivé son extraction à partir de végétaux.

[0027]Il est ainsi possible de l"isoler de l"huile d"olive, l"huile de palme, et dans d"autres huiles céréalières ou provenant

de l"amarante, des semences, du son de riz, de germes de blé.

[0028]Cependant, l"inconvénient majeur est ici que le squalène est extrait en très faibles quantités, de l"ordre de 0,1

à 0,7 % en poids.

[0029]En première alternative à ces procédés d"extraction à partir de foies de requins ou de végétaux, souvent rendus

coûteux par la mise en oeuvre de procédés d"enrichissement et de purification importants, ont été proposés de premiers

procédés de production de squalène à partir de microorganismes: levures naturelles ou levur es recombinantes, no-

tamment de type Saccharomyces.

[0030]C"est ainsi que Saccharomyces cerevisiae est connue pour sa capacité à produire du squalène, cependant en

très faible quantité: de l"ordre de 0,041 mg/ g de biomasse (BHATTACHARJEE, P. et al, 2001, dans World J. Microb.

Biotechnol., 17, pp 811-816).

[0031]L"optimisation de ces capacités de production a donc été travaillée, par le biais de la recombinaison génétique.

[0032]Les levures recombinantes qui produisent du squalène ont ainsi l"avantage: -de bénéficier du même statut GRAS (Generally Regarded As Safe) que la cellule hôte, -d"être exemptes de pathogènes, de prions ou de toxines, tout comme la cellule hôte, et

-d"avoir déjà été utilisées dans le domaine des vaccins (telles que ces levures qui expriment des vecteurs contenantdes antigènes de l"hépatite B).

[0033]Cependant, comme le présente la demande de brevet WO 2010/023551 pour le domaine médical (production

de squalène d"une pureté supérieure à 97 % comme adjuvant de vaccins), cette première alternative n"est industrialisable

que si l"on peut disposer de levures recombinantes hyperproductrices de squalène (à plus de 15 % en poids de cellules

sèches).

[0034]Or, l"obtention de ces cellules recombinantes nécessite la mise en oeuvre de nombreuses étapes lourdes,

longues et complexes d"ingénierie métabolique, par la mise en oeuvre d"outils de biologie moléculaire, conduisant à la

stimulation des voies de biosynthèse du squalène et à l"inhibition des voies du catabolisme du squalène.

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