DOSAGE DU SACCHAROSE
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DOSAGE DU SACCHAROSE DUN EXTRAIT DE SODA PAR
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Détermination de la concentration dune solution par réfractométrie
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S. Gillet - CBI - 1 -
S. Gillet - CBI - 2 -
TP1 : Extraction et dosage des sucres par HPAEC - PAD.1. Principe
La manipulation consiste à extraire les monosaccharides d"une matrice afin de les quantifier à l"aide d"une technique chromatographique basée sur l"échange d"ions. La technique (HPAEC - PAD) sera présentée en auditoire.Les étudiants seront contrôlés sur le dosage des sucres de l"échantillon inconnu ainsi que sur
la préparation d"une solution de standard et d"une solution test de glucose. Ils seront
également évalués sur la qualité du rapport de labo.2. Réactifs
- glucose, fructose, saccharose, lactose, galactose - eau distillée - réactifs à HPAEC-PAD (déjà préparés)3. Extraction
Remarques :
1. Vérifier dans le tableau affiché sur la hotte, la dilution finale à obtenir. Elle peut, selon
les cas, différer de celle proposée dans les notes ci-dessous2. Inscrire systématiquement sur la verrerie et les vials
: N° Echantillon / N° d"équipe.Pour les fruits à jus et les liquides :
A. presser le fruit dans un bécher ou prendre le tube échantillon correspondant.B. prélever avec précision 200 μl de liquide surnageant avec une pipette automatique et les mettre
dans un ballon jaugé de 100 ml.C. mettre au volume avec de l"eau.
D. boucher et agiter le ballon.
E. ajouter 2000 μl de la solution précédente dans un ballon jaugé de 10 ml. S. Gillet - CBI - 3 - F. mettre au volume avec de l"eau.G. boucher et agiter le ballon.
H. filtrer 1,5 ml sur 0,2 μm dans un vial HPLC.Pour les solides :
A. broyer le solide.
B. peser avec précision environ 200 mg de solide dans un bécher.C. ajouter 60 ml d"eau.
D. agiter au moyen d"un barreau magnétique sans perdre d"échantillon (évent. avec un ultraturrax).
E. enlever le barreau et le rincer à l"eau au dessus du bécher. F. transférer quantitativement la solution dans un ballon jaugé de 100 ml.H. mettre au volume avec de l"eau.
I. continuer les étapes E à H des liquides.
4. Préparation des standards
Peser avec exactitude les sucres suivant pour obtenir une concentration d"environ 1000 ppm pour le glucose, 1000 ppm pour le fructose, 2000 ppm pour le saccharose et 2000 ppm pour le lactose dans un ballon de 100 ml. (= solution de base SB)Remarque
: 1 Ppm = 1 mg/l.Solutions standards
SB Porter à
Std 1 50 μl 10 ml
Std 2 100 μl 10 ml
Std 3 250 μl 10 ml
Std 4 500 μl 10 ml
Std 5 1000 μl 10 ml
S. Gillet - CBI - 4 - Il sera demandé aux étudiants de préparer uniquement une solution standard au choix. Référez-
vous au tableau affiché sur la hotte.5. Préparation de la solution test de glucose
A. Préparer avec précision une solution d"environ 360 ppm en glucose dans un ballon de 100 ml.B. Prélever 1 ml de cette solution et l"introduire dans un ballon jaugé de 10 ml. Mettre au volume
avec de l"eau = solution test glucose6. Analyse
L"appareil et les conditions opératoires seront présentés au TP. Le pH et la quantité de contre-ions
injectés sont bien sûr les paramètres les plus importants sur lesquels il faut jouer pour garantir une
séparation optimale des sucres.7. Résultats
La méthode utilisée ici pour le dosage quantitatif des différents sucres est la calibration
externe. Elle consiste à préparer des solutions standards de concentrations connues contenantles différents sucres que l"on souhaitera doser dans un échantillon. Plusieurs solutions
standards de concentrations croissantes (et connues) seront donc préparées et injectées en HPAEC-PAD. Il sera ainsi possible, pour chaque sucre, de mettre en relation une concentration donnée avec une aire observée sur le chromatogramme.La droite obtenue par cette méthode permettra de déterminer la concentration d"un échantillon
inconnu à partir de son aire sous son pic.Pour identifier correctement un pic dans un mélange complexe, il faut au préalable déterminer
l"ordre d"élution des différents sucres. Pour ce faire, des solutions contenant chacun des sucres
séparément on été injectées au préalable. Le temps de rétention de chaque sucre a ainsi pu être
obtenu et chacun d"eux pourra être repéré sur un chromatogramme contenant un mélange de plusieurs sucres. L"ordre d"élution est le suivant : glucose, fructose, lactose et saccharose.S. Gillet - CBI - 5 -
TP2 : Dosage des monosaccharides par CPG
1. Principe
Les polysaccharides sont des chaines de sucres (de monosaccharides) reliés par des liaisons glycosidiques. Les polysaccharides diffèrent par la nature des sucres qui les constituent, le type de liaison entre les monosaccharides, etc. La liaison entre deux sucres simples d"un polysaccharide peut-être clivée enzymatiquement, chimiquement ou mêmephysiquement (T° et P). Cela va libérer un ensemble de monosaccharide dont le ratio
caractérise le polysaccharide. Le pourcentage de polysaccharides d"un échantillon peut ainsiêtre estimé par un bilan massique entre la quantité de monosaccharides analysée et la pesée de
départ de l"échantillon. Au labo, un polysaccharide inconnu va être hydrolysé en monosaccharides qui vontensuite être dosés par chromatographie en phase gazeuse après dérivatisation en acétates
d"alditols (figure 1). Cette étape est nécessaire car le sucre " tel quel » n"est pas volatil et ne
peut donc pas être analysé en GC. L"inconvénient majeur de cette méthode est qu"elle ne permet pas de faire la distinction entre le glucose et le fructose, après dérivatisation. Les grands principes de la chromatographie en phase gazeuse seront présentés en auditoire. Figure 1 : transformation d"un monosaccharide en acétate d"alditol, pour analyse GC-FID. Les étudiants seront évalués sur le dosage des monosaccharides obtenus après hydrolyse, sur le ratio en sucre (et donc l"origine) du polysaccharide, sur le pourcentage de saccharides dans l"échantillon de départ ainsi que sur la qualité du rapport de labo.S. Gillet - CBI - 6 -
2. Réactifs
- Un polysaccharide inconnu - NaBH4 dans DMSO (déjà préparé)
Peser 2 g de NaBH
4 (98% Sigma) et porter à 100 ml dans un ballon jaugé avec DMSO
(Diméthylsulfoxide anhydre, Merck Eurolab). Chauffer à 100°C dans un bain-marie et agiter la solution jusqu"à dissolution complète.quotesdbs_dbs2.pdfusesText_2[PDF] refractometre raisin
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