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Il est néanmoins précisé que chaque école peut imposer des conditions d'admission particulières (cf. page spécifique à chaque école). L'inscription de candidats
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La PCR quantitative (qPCR) et le guide de bonnes pratiques MIQE
1 Département SNES Institut. Polytechnique LaSalle Beauvais
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Ecole. Institut polytechnique UniLaSalle. Etablissement privé labellisé EESPIG. Nom d'usage : UniLaSalle. Académie : Amiens. Sites de l'école : Beauvais
Notice relative aux modalités dadmission à lune des 65 écoles de
6 avr. 2021 Coûts d'inscription aux concours de la banque e3a-Polytech ... POLYTECH Angers – École polytechnique de l'Université d'Angers.
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11 janv. 2022 MÉTIERS et Concours École Polytechnique. Elle comprend un groupe de 13 ... UniLaSalle Beauvais - Sciences de la Terre et Environnement.
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Le calculateur proposé en parallèle de ce guide ainsi que la notice correspon- •Christine LECLERCQ
Institut Polytechnique UniLaSalle
This Private graduate school called ISAB (Institut Supérieur Agricole de Beauvais) was created in 1854 by the Christian Brothers with a speciality in Agriculture In 2006 more than 150 years later the school merged with the Geological Institute IGAL and has been called Institut Polytechnique LaSalle Beauvais until 2016
© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am
doi:10.1684/abc.2014.0955 265Pour citer cet article : Dooms M, Chango A, Abdel-Nour A. La PCR quantitative (qPCR) et le guide de bonnes pratiques MIQE : adaptation et pertinence dansle contexte
de la biologie clinique.Ann Biol Clin2014 ; 72(3) : 265-9 doi:10.1684/abc.2014.0955Synthèse
Ann Biol Clin 2014 ; 72 (3) : 265-9
La PCR quantitative (qPCR) et le guide de bonnes
pratiques MIQE : adaptation et pertinence dans le contexte de la biologie clinique Quantitative PCR (qPCR) and the Guide to good practices MIQE: adapting and relevance in the clinical biology contextMaxime Dooms
1Abalo Chango
1AÞf Abdel-Nour
2 1Dpartement SNES, Institut
Polytechnique LaSalle Beauvais, Unit
de recherche EGEAL UP-2012.10.101,France
Special Infectious disease unit, King
Fahd Medical Research Center, King
Abdulaziz University, Jeddah, Kingdom
of Saudi ArabiaArticle recüu le 18 octobre 2013,
accept"e le 03 fvrier 2014 cesse croissante dans lÕobtention des rsultats dÕtudes et de diagnostics. Avec une telle utilisation, la question de la Þabilit et de la pertinence des rsultats et informations produits est pose. Cette revue offre une rponse documente cette question : le guide de bonnes pratiques MIQE :minimum information cessus dÕextraction et de lÕanalyse de lÕinformation biologique y est traite, avec pour chaque tape une rponse simple. Les contraintes techniques de la recherche ont t intgres aÞn de permettre une application plus raliste de lÕapplication du guide. Mots clés :bonne pratique, guide, MIQE, PCR, PCR quantitative Abstract.The qPCR has been introduced in clinical and biomedical research for over 10 years from now. Its use in trials and diagnostics is continuously increasing. Due to this heavy use, the question of relyability and relevance of qPCR results has to be asked. This review proposes a documented and evidence based answer to this question, thanks to the MIQE (minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments) guideline. The whole Simple answers are given, taking into account the technical constraints from clinical research in order to allow a realistic application of this guideline. Key words:best practice, guideline, MIQE, PCR, quantitative PCR La PCR quantitative (qPCR), dont l'ancienne appellation Ç PCR en temps rel È tend "tre abandonne cause de la confusion induite par la terminologie anglaise RT-PCR un outil puissant pour lÕanalyse en biologie molculaire et ou ARNm principalement) pour caractriser lÕactivit dÕun protines dans divers chantillons [1]. Son utilisation dans le cadre de la recherche et plus particu- comme le montre lÕvolution des publications depuis 2002 (figure 1). Ceci s'explique en grande partie par la faci- lit quÕoffre cette technique pour produire des rsultats a sensibilit de la technique qui permet la dtection de varia- tions mineures des squences dÕacides nucliques (ADN, cDNA, ARN), et galement sa spciÞcit qui permet de discriminer quantitativement des cibles molculaires [2]. Actuellement, la PCR digitale en gouttelettes (ddPCR) se dveloppe et se dmocratise, offrant un pouvoir dis- criminant et une sensibilit accrus [3]. Du fait de ces caractristiques techniques toujours amliores, des diff- en vidence. La question de la pertinence biologique de ces la sensibilit progresse (figure 1).Tirés à part :A. Chango© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am
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qPCRqPCR + clinical Figure 1.Nombre d'articles publiés par mots clés (qPCR, qPCR + clinique) et par anne (source : NCBI). tant de noter que le recours la qPCR permet souvent de un dsagrment aussi mineur que possible pour le sujet ou le patient. En effet, le volume requis peut "tre extr"mement faecespour l'étude du microbiote colique [4]. Malgr la performance reconnue de cette technologie, lÕutilisation courante ne doit pas occulter la ralit bio- logique tudie. SÕil est en vrit assez facile de gnrer des donnes en qPCR, la garantie de leur qualit et leur adquation avec la ralit biologique tudie est autrement parfois passer sous silence lÕabsence de contrle plutt que de mentionner quÕelle nÕa pas effectu ledit contrle. Ceci nuit la transparence et laisse la suspicion sÕimmiscer dans la littrature scientiÞque. Rcemment, une mthodologie visant rduire les mani- pulations ncessaires une bonne pratique a t publie [5]. Cette mthodologie recourt lÕestimation de certains de qualit valorisable sa juste mesure.
Utilité du guide de bonnes pratiques
MIQE Garantir la qualité des données proposées par la qPCR sup- pose, dÕune part, que lÕanalyse soit rigoureuse et, dÕautre problmatique est lie lÕutilisation de la qPCR et nÕest pas spciÞque au contexte clinique. Aussi il semble trivial de se rfrer un guide de bonnes pratiques cohrent qui de surcroit existe [7] : le guide de bonnes pratiquesMini- mum information for publication of quantitative real-time publication dÕexpriences utilisant la PCR quantitative). Ce guide publi en 2009 offre une liste dÕinformations, essentielles ou simplement souhaitables, porter la propose une tracüabilit de la ralit biologique. Chaque tats, mais aussi leur comprhension et leur adquation avec une ou plusieurs rfrences qui dmontrent la pertinence de chacun. Le guide est souvent synthtis par un tableau recherche apporte un ct pratique indniable. Ce tableau a aussi t adapt dans une application pour tablettes et smartphones, MIQE qPCR (en anglais, disponible gratuitement sur lÕapp store, Apple). Initialement publi en anglais, ce tableau est maintenant disponible en francüais poster.pdf).Présentation du guide
Le MIQE guide propose par essence une ligne de trans- parence et non une norme. Il est donc lgitime de pouvoir en discuter la pertinence et le cas chant dÕy apporter des amendements pour sÕadapter un contexte, clinique par exemple. Sur le point de lÕadaptabilit et de la pertinence, il est important de mentionner que le guide ne subit pas dÕadaptations par dfaut de pertinence. Ë lÕinverse, il tire sa pertinence (au-del des rfrences bibliographiques sur lesquelles il sÕappuie) de son adaptabilit et de sa prise en tes exprimentaux. LÕessentiel dans ce guide est la volont profonde dÕoffrir de la transparence, de la lisibilit et de la socle dÕinformations contribuant ces objectifs. Cette liste se prsente en diffrentes sections dtailler.Nomenclature
ne rev"t que peu dÕintr"t eu gard lÕabsence de cette faute en francüais (alors quÕil est frquent en anglais de lire Ç quantitation È au lieu de Ç quantiÞcation È). En revanche,© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am
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PCR quantitative et guide MIQE
(cycle threshold, cycle seuil) par les termes " Gènes de rfrence È, et Ç Cq È (Cycle de quantiÞcation) rev"t un De m"me lÕappellation qPCR est favoriser au dtriment confusion entre le fait que la PCR soit quantitative (real tion, RT), parfois jusque dans les publications. EnÞn, lÕemploi de termes gnriques comme Ç sonde hydrolyse È en lieu et place de Ç sondes TaqMan TMÈ per-
met de sÕaffranchir de lÕutilisation de marques mauvais escient. Prciser la technologie dÕune sonde ßuorescence apporte plus dÕinformation et moins de confusion quÕune marque utilise comme un gnrique (surtout quand la marque effectivement utilise nÕest pas celle qui a donn son nom). Eu gard lÕimportance que rev"t le vocabu- laire dans la comprhension dÕun texte et lÕinformation quÕil vhicule, lÕensemble des items de cette catgorie sont essentiels. LÕensemble de ces termes courants revus par le guide sont rapports dans la section Ç nomenclature È du guide MIQE [7].Plan d"expérience
Dans une expérience - et à plus forte raison dans une étude clinique Ð le plan dÕexprience est une cl de lecture quÕil convient de prciser convenablement pour garantir au lec- liste nÕest encore une fois pas limitative, mais il semble que fournir les effectifs des groupes (en dbut et Þn dÕessai le groupes exprimentaux est un minimum indispensable. Par de communiquer le ralisateur effectif (interne ou presta- bution effective des diffrents auteurs. Dans un contexte de la biologie clinique, il est vident que ces informations initiales gagneront "tre compltes par dÕautres infor- mations complmentaires : intervention ou observation, enEchantillonnage
Le contexte linguistique et expérimental étant posé, il chantillons analyss. Ceci est primordial dans la mesure o leur manipulation peut induire leur altration et poten- tiellement briser la cha"ne de lÕinformation biologique obtenu en qPCR. Parmi les informations fournir on citera la nature de lÕchantillon, la procdure dÕchantillonnage ayant conduit lÕobtention des chantillons, leur ventuel leurs conditions de stockage (dure, temprature, si perti- nent conditions physico-chimiques). La majeure partie des informations de cette catgorie sont essentielles. Seul le volume ou la masse dÕchantillon utilis est souhaitable et non essentiel.Extraction des acides nucléiques
Dans l'hypothèse où l'information soit arrivée intacte à ce stade de lÕexprience, il est crucial de ne pas la dgrader lors de son extraction et de lÕextraire pleinement aÞn de ne pas commettre si lÕon peut dire un mensonge par omis- tape. Prciser que Ç les ARNm ont t extraits conform- ment aux instructions du fabricant È ou Ç en suivant les prconisations de Doomset al., 2013 » ne suffit pas. Une publication est faite pour communiquer de lÕinformation scientiÞque, pas pour faire un jeu de piste. Un protocole dÕextraction est parfois complexe, offre plusieurs possibili- lÕarticle contienne elle-m"me un renvoi, voire quÕin fine l'information ne soit pas suffisante. Pour peu que le lec- teur ne soit pas abonn la bonne revue ou que sa patience montre rapidement ses limites, lÕinformation sÕarr"te aux portes du processus de diffusion. Aussi, il est essentiel de centraliser les informations dans un rapport ou un tableau li votre publication. Concer- nant les informations pour lÕextraction dÕacides nucliques Þgurent celles du kit utilis et/ou lÕinstrumentation asso- cie lÕextraction, les ventuelles modiÞcations apportes (en dtails, pas seulement Ç kit X modiÞ È qui nÕapporte aucune prcision si ce nÕest que lÕinformation est perdue), lÕorigine des ractifs supplmentaires le cas chant, les traitements de type DNAses ou RNAses, la vriÞcation dÕabsence de contamination (ADN ou ARN), la qualit de lÕacide extrait (intgrit, puret), la vriÞcation dÕabsence dÕinhibiteurs (par des sries de dilutions par exemple).Rétrotranscription
est dans lÕimmense majorit des cas ncessaire dÕeffectuer une rtrotranscription (que lÕon notera sans vergogne Ç RT È puisquÕayant mentionn la PCR quantitative avec lÕappellation qPCR et non RT-PCR). L encore, la tracüabilit de lÕinformation biologique est essentielle. Elle est de surcro"t assez facile assurer. Il sufÞt de mention- ner la quantit dÕARN utilise pour la rtrotranscription, lÕenzyme et sa concentration (ou simplement le kit utilis), le type dÕamorces utilises (oligo dT, amorces alatoires), les conditions (temps, tempratures, volume ractionnel). Bien que ce ne soit pas essentiel, la communication des Cq© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am
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Synthèse
avant et après RT et les conditions de stockage des ADNc est souhaite.Cible de qPCR
Arrivé à ce stade, pour peu que les informations men- tionnes ci-dessus aient t communiques, le lecteur est en mesure dÕapprcier la conservation de lÕinformation. Reste lire cette information. L encore la transparence est de mise. LÕidal est bien entendu la prsence de des variants dÕpissage le cas chant et la situation de la squence cible (en particulier lÕemplacement vis--vis des squences introniques ou exoniques). La longueur et les structures secondaires pouvant inßuencer lÕefÞcacit de lÕampliÞcation, ces informations sont galement commu- niquer. Au-del des aspects techniques lis la cible ampliÞer, il est important de sÕassurer quÕelle est bien spciÞque, quÕelle ne comporte pas dans le gnome ou le transcrip- mauvais ciblage produirait en effet un rsultat parfaite- ment lisible, mais sans lien sufÞsamment troit avec le biologique.Oligonucléotides
Ce sont eux qui vont permettre de lire l'information. Ils De la m"me facüon quÕil est essentiel dÕavoir une pharmacie efÞcace pour mettre en branle les traitements proposs par la mdecine, il est important de sÕassurer de la qualit et de la pertinence des oligonuclotides pour une cible donne. quent est la publication des squences utilises. Lors de lÕutilisation de kits commerciaux les rfrences de ces derniers doivent "tre fournies, en vitant dans la mesure du possible les boites noires qui proposent des essais pr"ts lÕemploi sans prcisions sur les squences ou au moins leur contexte. Lors de lÕutilisation dÕamorces ou de sondes modiÞes, il est crucial de communiquer prcis- ment les modiÞcations effectues. EnÞn, dans un but de lisibilit de lÕexprience et de reproductibilit, les informa- tions sur le fournisseur et la mthode de puriÞcation des amorces/sondes doivent "tre transmises.Protocole de qPCR
Pour filer la métaphore médico-pharmaceutique, nous sup- posons ici "tre en prsence dÕun bon diagnostic (contexte exprimental), dÕune bonne prescription (cible de qPCR) et dÕun traitement adapt (oligonuclotides). Reste prci- ser le mode dÕadministration du traitement, ici le protocole de qPCR. Tous les lments tant runis, reste les faire ragir de facüon adquate. Les lments essentiels sont la nature et la concentration de lÕenzyme utilise, la quantit dÕADN ou ADNc utilise pour chaque raction, la compo- sition du milieu ractionnel (tampon, concentration en Mg, raction (machine utilise, volume et programme de ther- mocyclage). Par ailleurs, en ce qui concerne la qualit des plastiques pouvant inßuencer la raction, il est bon de la prciser. EnÞn, dans un contexte clinique o la quantit dÕchantillons manipuler est souvent importante, le fait est important. On peut en effet concevoir que lÕassistance dÕun automate permette de rduire les erreurs de pipetage et ainsi dÕaugmenter la rptabilit des rsultats. Cet effet croit avec la taille de la population analyse.Validation de la qPCR
À ce stade, l'information brute est livrée. Il est tentant de passer directement lÕanalyse pour obtenir au plus tt ce que lÕon pense "tre un rsultat. Nanmoins, quelle serait la valeur dÕun rsultat issu de donnes brutes non valides ?Nulle.
En complment Ð et non en remplacement ! Ð des infor- mations mentionnes ci-avant, des vriÞcations simples permettent de valider les donnes brutes. La qPCR est- elle bien spciÞque (vriÞable avec une courbe de fusion lÕutilisation de SYBR Green est-elle lie la cration dÕun produit de PCR (quelles sont les valeurs de Cq pour les chantillons tmoins) ? La qPCR est-elle efÞcace et Þable tout au long de la gamme de valeurs observes (quelles sont pour chaque essai les variations au long de la gamme est lÕefÞcacit lisible sur la courbe et quel est le R 2 Rpondre ces questions ne prend que peu de temps. Les rponses dpendent globalement de la nature de lÕchantillon et de lÕessai, et ne varient que peu entre plu- sieurs individus.Analyse des données
Enfin, le temps de la valorisation des données brutes (vali- des) en rsultats exploitables est venu. Comme tout au lecteurs dÕapprcier la qualit de lÕexprimentation. Les points mentionner comportent le programme utilis pour lÕanalyse (et sa version !), la mthode de dtermination du les donnes et les dispositions prises dans le cas de valeurs© John Libbey Eurotext, 2014Journal Identification = ABC Article Identification = 0955 Date: May 17, 2014 Time: 11:5am
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PCR quantitative et guide MIQE
suspectes. Concernant l'analyse, elle ne sera complète que si la rptabilit et la reproductibilit de lÕexprience sont estimes (stade et nombre des rplicats techniques et biolo- (calcul de puissance, tests statistiques utiliss). La perfection serait approche si les donnes brutes taient soumises au format RDML, prvu pour la communication de ce type dÕinformation.Impact sur la recherche clinique
Dans la mesure où l'ensemble des informations men- tionnes ci-dessus tend "tre communiques, lÕintgrit et la pertinence des donnes doivent "tre garanties. Le contexte clinique impose par nature une exigence dans la qualit de la conduite exprimentale et la garantie du suivi des donnes. Dans cette optique, certains points de qui dans un contexte de tension des ressources peut ralentir rie pas dÕexpriences supplmentaires. Cette mthodologie cation de la qualit selon les ressources disponibles et ainsi pris pour garantir la tracüabilit des rsultats. LÕobjectif est donne gnre de valoriser la recherche scientiÞque en connaissance de cause.Conclusion
ra"t ncessaire de proposer un guide cohrent de bonnes Cette sensibilit toujours en hausse et dont on peuta priori se réjouir, représente néanmoins un risque si l'information nÕest pas trace biologiquement. La sur-interprtation de rsultats faussement intressants peut induire en erreur. La conciliation de lÕexigence de rsultats de la recherche biomdicale face aux enjeux de sant publique et celle non moins imprieuse de se cantonner aux ressources dis- rigueur scientiÞque ncessaire la parution de rsultats de ressources (taille des chantillons, multiples rplicats). bonne lisibilit des articles scientiÞques, et la mthodolo- gie voque permet dÕestimer ces informations sous forte contrainte de ressources. Nous esprons que ce guide dont lÕapplication rcente commence par sÕimposer progressi- vement apportera une grande souplesse et garantie dans le croisement des rsultats et dans le cas des tudes multicen- triques. Liens d"intérêts :Les auteurs déclarent ne pas avoir de lien dÕintr"t en rapport avec cet article.Références
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