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DOSAGE DE SUBSTRAT Méthode enzymatique « en point final » 1 Principe général On dose le produit formé ou le substrat disparu, par méthode 

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2° substrat de l'enzyme que l'on apporte dans le milieu réactionnel et P et Q concentration en glucose par méthode enzymatique au point final de la réaction

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Soit par la vitesse de disparition d'un substrat 2 Soit par la Méthode en point final ou « à deux points » Prise d'essai de sérum contenant l'enzyme à doser;

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A Méthodes en deux points : cinétiques en un temps fixé B Méthodes le choix d'une concentration finale en substrat supérieure ou égale à 10 km permet tions enzymatiques permet le dosage du produit de la première réaction dans un

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les dosages de SUBSTRAT par méthode enzymatique en point final ; • les dosages d'ENZYMES par détermination de leur concentration catalytique Et, selon 

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deux points Distinguer dosage de substrat et mesure d'activité enzymatique Le cholestérol est dosé par une méthode enzymatique ײ en point final ײ

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le 2° substrat de l'enzyme que l'on apporte dans le milieu réactionnel et P et concentration en glucose par méthode enzymatique au point final de la réaction

[PDF] Thème 5 – Chapitre 3 – Activité 5

Éléments de réponse 1 PRINCIPE DU DOSAGE DU SACCHAROSE PAR UN KIT ENZYMATIQUE La réaction principale est celle dont le substrat est la molécule à doser : réaction catalysée par la saccharase (dosage en point final ) 2 3

[PDF] 6-Activité enzymatique

l'enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets s'il est impossible de doser le produit en présence du substrat également, un délai dans la réaction peut sous-estimer la vitesse à partir d'un seul point le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de

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enzymatique

DR AKSAS

1

ƒIl

2

Cette mesure consiste à évaluer la

3

L'actiǀitĠ d'une enzyme se mesure

1.d'un

d'apparition d'un

3.d'utilisation d'un

4

Méthodes de mesure

2 Méthode en point final ou " à deux points »

Méthodes cinétiques:

1. 5 Si expérimentales[S]0 et[S]0 la d'enzyme C'est doser d'enzyme 6

Conditions opératoires

et maximale a)0et déterminer contient. b) optimale c) [S]( activateurs 7

Le substrat

Le Pour Pour Il doitMais Un de on exige que S > 10 Km. 8

Température

En , C

SFBC(société

C 9

La durée de la mesure

AE = Vi en [ ] saturante de substrat

10 10

Le Témoin

Dans les méthodes " 2 points »

On Ce que .

Dans les méthodes cinétiques

On 11

Les unités enzymatiques

katalquantité seconde trop-

Launité

internationalequi catalyse minute 60
12

Les unités enzymatiques

Nombre

AEM

Nombre

AS

Elle enzymatique

13

Les unités enzymatiques

ƒLe=

/ Activité enzymatique totale de départ (x

ƒ Le=

spécifique de départ 14 1 manuelle 1. durée, 2.son 3.

Į .15

Méthode en point final ou à " 2 points »

Ladoit

Le lorsque nécessaire

¾soit

¾soit

zone0en

¾soit.

16

Méthode en point final ou à " 2 points »

Faire Ce (Exemple transformer 17

Méthode en point final ou à " 2 points »

Exemple:

LetĮ-;

-30. -Dinitro 18 ALAT

Méthode en point final ou à " 2 points »

C solution 19 2

Consiste de

La spécifiqueUV visible

tempsplus 20

Cinétique enzymatique en Ultra

LeNAD/NADH NADP/NADPH

employé La

UV NAD+/NADHqui

sont Ces Cette 21

Méthodes cinétiques

Dans continu, fixée La réactif) stabilise Elle

Ppermet

22

Cinétique enzymatique en Ultra

NAD considérés(réaction

AH2 + NAD+ A + NADH,H

AH2 + NADP+ A + NADPH,H

[NAD+ ] > 10 NAD 23

Cinétique enzymatique en

NADH NAD+, Si réduction NAD+,la; oxydation deDO. Le

NADPHİ -cm- 24

Cinétique enzymatique en

NADH-cm-

NAD+ 25

AEMesure

de 340nm

AE diminution

de A340nm LDH NADн et NADH2 prĠsentent un pic d'absorbtion ( surtout NAD+) a 260 nm alors on mesure électivement Le NADH2 a 26

A 340 nm ( UV) Si on mesure :

27

Cinétique enzymatique en Ultra Violet

Condition cte

permet Dans tampon à

NADH,H .

Puispyruvate

On La droite 28

Lactate déshydrogénase

(EC 1.1.1.27)

Lactate = substrat

Pyruvate = produit

NAD+/NADH = cofacteur

29

Cinétique enzymatique en

OnDO/min

déclenchée, Les On

T E 3 UI.l-

VTet VE en3

30

Cinétique enzymatique en

DO = İ

DO1 İ 1 1=1 İ

DO2 İ 2 2=2 İ

2-1=DO2 İ DO1 İ

0 31

Cinétique enzymatique en

= x x 6

A 340 nm İNADH,H + = -. cm-.l.

AE en 32
VE VT

Réactions enzymatiques couplées

déshydrogénase à NAD+ ou NADP+ et que ni S et ni P ne possèdent de propriétés spectrales, alors on couple la première R à une deuxième, catalysée par une déshydrogénase dont P est le substrat. S P PH2 33
E1

NADH,H NAD+

Réactions enzymatiques couplées

La 1ere R principale

La 2eme R indicatrice

34

Réactions enzymatiques couplées

Exemple

Acɲ-

AOANADH,H Malate NAD+

35
ASAT

Réactions enzymatiques couplées

A correspond NADH,H . Dans 36

Réactions enzymatiques couplées

AE1 = AE2

Pour 1. pendant en 2. Dans pourV 37

Etude de trois R couplées

on couple la 1ere même couplée à une R indicatrice. S P X XH2 38

NADH,H

NAD+ E1 V2 V1 E2 V3 E3

R principale

R auxiliaire R indicatrice

Etude de trois R couplées

ExempleCK

R

CréatineATP

R

ATPglucose+

R

G+ NADPH,H+

On 39
CK hexokinase G6P

Déshydrogénase

Cinétique enzymatique colorimétrique

Exemple: Dosage des phosphatases alcalines (PAL)

p Le Le2;

Dosage

enregistrement = İ VT E 6UI-

İ 405 - -.

40
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