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DOSAGE DE SUBSTRAT Méthode enzymatique « en point final » 1 Principe général On dose le produit formé ou le substrat disparu, par méthode 

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2° substrat de l'enzyme que l'on apporte dans le milieu réactionnel et P et Q concentration en glucose par méthode enzymatique au point final de la réaction

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Soit par la vitesse de disparition d'un substrat 2 Soit par la Méthode en point final ou « à deux points » Prise d'essai de sérum contenant l'enzyme à doser;

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A Méthodes en deux points : cinétiques en un temps fixé B Méthodes le choix d'une concentration finale en substrat supérieure ou égale à 10 km permet tions enzymatiques permet le dosage du produit de la première réaction dans un

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les dosages de SUBSTRAT par méthode enzymatique en point final ; • les dosages d'ENZYMES par détermination de leur concentration catalytique Et, selon 

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deux points Distinguer dosage de substrat et mesure d'activité enzymatique Le cholestérol est dosé par une méthode enzymatique ײ en point final ײ

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le 2° substrat de l'enzyme que l'on apporte dans le milieu réactionnel et P et concentration en glucose par méthode enzymatique au point final de la réaction

[PDF] Thème 5 – Chapitre 3 – Activité 5

Éléments de réponse 1 PRINCIPE DU DOSAGE DU SACCHAROSE PAR UN KIT ENZYMATIQUE La réaction principale est celle dont le substrat est la molécule à doser : réaction catalysée par la saccharase (dosage en point final ) 2 3

[PDF] 6-Activité enzymatique

l'enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets s'il est impossible de doser le produit en présence du substrat également, un délai dans la réaction peut sous-estimer la vitesse à partir d'un seul point le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de

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Thème 5 - Chapitre 3 - Activité 5

INFLUENCE DE L'AUTOCLAVAGE SUR LES GLUCIDES CONTENUS

DANS LES MILIEUX DE CULTURE

Éléments de réponse

1. PRINCIPE DU DOSAGE DU SACCHAROSE PAR UN KIT ENZYMATIQUE 1.1.

Le saccharose est hydrolysé en glucose et en

fructose. Le glucose est ensuite converti en glucose 6P. Enfin, la transformation du glucose6P permet la formation de NADPH,H . Ce dernier composé absorbe, il peut être dosé par spectrophotométrie. nsaccharose n glucose n glucose6P n

NADPH,H+formé

1.2. À 340 nm, l"absorbance est maximale pour le NADPH,H et le NADP n"absorbe pas à cette longueur d"onde. 1.3. Le nom usuel de la première enzyme est la saccharase car elle hydrolyse le saccharose.

1.4. Enzyme Classe Justification

Saccharase Hydrolase Cette enzyme hydrolyse le

saccharose. Hexokinase Transférase Cette enzyme transfère un groupement phosphate de l'ATP au glucose ou au fructose. Glucose 6P déshydrogénase Oxydo-réductase Cette enzyme transfert des

électrons et des protons du

glucose6P au NADP 1.5. Le premier chiffre du numéro de code indique la classe à laquelle appartient l'enzyme. Le 3 correspond à la classe des hydrolases. L'enzyme 3.2.1.26 est donc la saccharase. 1.6.

La réaction principale est

celle dont le substrat est la molécule à doser : réaction catalysée par la saccharase. La réaction indicatrice fait apparaitre un produit qui absorbe : réaction catalysée par la déshydrogénase. Les réactions auxiliaires correspondent aux autres réactions mises en jeu au cours du dosage : réactions catalysées par l'héxokinase. 1.7. Une enzyme est spécifique du substrat sur lequel elle agit. Le lactose ne devrait pas fausser les résultats du dosage. INFLUENCE DE L'AUTOCLAVAGE SUR LES GLUCIDES CONTENUS DANS LES MILIEUX DE CULTURE

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1.8.1.

Cas 1 Cas 2 Cas 3

Le saccharose reste intact

lors de l'autoclavage

Le saccharose est hydrolysé

en glucose+ fructose Le saccharose est totalement dégradé

Il y a production de

NADPH,H

: lors du dosage le saccharose est transformé en glucose puis en glucose6P et il y a production de

NADPH,H

par la déshydrogénase. Il y a production de

NADPH,H

Lors du dosage, le glucose

présent dans le milieu est transformé en Glucose6P et il y a donc production de

NADPH,H

par la déshydrogénase. Il n'y a pas de production de

NADPH,H

car le saccharose, le fructose et le glucose ont été totalement dégradés par l'autoclavage.

1.8.2.

Il est nécessaire de doser spécifiquement le glucose libre dans le milieu après autoclavage sinon il est

impossible de distinguer les cas 1 et 2 présentés précédemment.

2. MODE OPÉRATOIRE DU DOSAGE DU SACCHAROSE

2.1.

Le réactif 2 contient l'ensemble des éléments nécessaires pour que les réactions enzymatiques

s'effectuent sauf le NADP+ (réactif 1) : - les enzymes : . saccharase . hexokinase . glucose6P déhydrogénase - ATP - tampon 2.2.

Le temps doit être suffisamment long car il faut que les réactions soient toutes terminées (dosage en

point final). 2.3.

La température influence la vitesse des réactions enzymatiques. Une diminution de la température

entraine une diminution de la vitesse de catalyse. Il est donc nécessaire d'augmenter le temps d'incubation.

2.4.1.

Dans le bouillon M17, il y a 5 g de saccharose pour 1 L de milieu. La concentration en saccharose sera de 0,5 g.L -1 dans ce milieu dilué au 1/10. Cette dilution est donc correcte puisque la concentration obtenue se situe bien entre 0,05 et 0,8 g.L -1

2.4.2.

Pour effectuer le dosage, il est nécessaire d'avoir 0,1 mL d'échantillon. On peut donc préparer

500

µL de milieu dilué ainsi :

- 50 µL de milieu ; - 450 µL d'eau. INFLUENCE DE L'AUTOCLAVAGE SUR LES GLUCIDES CONTENUS DANS LES MILIEUX DE CULTURE

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2.5.

Un témoin permettant de prendre en compte la couleur de l'échantillon pourrait être réalisé ainsi :

- 2,42 mL d'eau physiologique ; - 0,1 mL de milieu à doser.

3. ANALYSE DES RÉSULTATS

3.1. La concentration en saccharose pour l'étalon est connue, elle est

égale à 0,5 g.L

-1 donc

Avant autoclavage Après autoclavage

E1 E2 E3 E'1 E'2 E'3

C (g.L

-1 ) 0,500 0,505 0,496 0,527 0,558 0,493 3.2. Pour chaque milieu, trois essais ont été effectués donc 3,3 x

Sr = 0,066

g.L -1 - essais avant autoclavage : Cmax - Cmin = 0,505 - 0,496 = 0,009 g.L -1

3 ,3 x Sr

Les résultats ont donc bien été obtenus en condition de répétabilité donc : C avant autoclavage =0,500 g.L -1 - essais après autoclavage : Cmax - Cmin = 0,558 - 0,493 = 0,065 g.L -1

3 ,3xSr

Les résultats ont donc bien été obtenus en condition de répétabilité donc : C après autoclavage =0,526 g.L -1 3.3. Pour réaliser les essais, les milieux ont été dilués au 1/10 e , il est donc nécessaire de multiplier les résultats obtenus précédemment par 10. De plus, l'incertitude élargie (U) est égale à 0,4 g.L -1 , on obtient donc : C avant autoclavage = (5,0 +/- 0,4) g.L -1 et C après autoclavage = (5,3 +/- 0,4) g.L -1 3.4.

Compte-tenu de l'incertitude sur les résultats obtenus, les concentrations avant et après autoclavage

ne sont pas significativement différentes. La technique d'autoclavage utilisée n'a pas modifié la

concentration en saccharose dans le milieu de culture.quotesdbs_dbs50.pdfusesText_50