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Système Biolog GEN III

Identification de bactéries aérobies Gram négatif et positif

Ann-Marie Breton, Agronome phytopathologiste

Marion Berrouard

, Technicienne de laboratoire

Lise Vézina

, Technicienne spécialiste

Direction de la phytoprotection

- MAPAQ

Les systèmes développés par la compagnie

Biolog visent l'identification de bactéries, levures et champignons. Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection du ministère de l'Agriculture, des

Pêcheries et de l'Alimentation (MAPAQ), nous

util isons le système permettant l'identification des bactéries aérobies Gram négatif et positif. Il nous est particulièrement utile pour identifier les

Pseudomonas, Xanthomonas, Pectobacterium,

Pantoe

a, Burkholderia, Serratia, Acidovorax et tous autres genres bactériens répertoriés par le système Biolog (entre 1500-1600 espèces de bactéries). Ces bactéries sont habituellement responsables de s symptômes de taches, brûlures et pourritures molles. Les images suivantes permettent de visualiser des symptômes d'origine bactérienne sur diverses plantes cultivées.

Pour le diagnostic des maladies bactériennes,

la première étape consiste à isoler la bactérie des tissus végétaux. Les isolements sont réalisés sur des milieux de culture gélosés soit B de King pour les Pseudomonas (King, E.O., M.K. Ward et D.E.

Raney. 1954), MS pour les Pectobacterium

(Miller-Schroth medium) et LPGA (Levure

Peptone Glucose Agar) pour les autres genres

bactériens. À la suite du trempage des tissus végétaux dans une solution saline (NaCl 0,85 %) pendant 30 minutes, la suspension est étalée par

épuisement sur les milieux de culture

L'incubation se fait à 26o

C et e

lle est généralement de 48

à 72 heures afin d'obtenir

des colonies de 1 à

2 mm de diamètre.

INTRODUCTION ISOLEMENT

Pseudomonas syringae pv.

apii sur le céleri

MAPAQ Xanthomonas campestris

pv. campestris sur le chou MAPAQ Xanthomonas campestris pv. vitians sur la laitue MAPAQ MAPAQ MAPAQ L'identification des bactéries aérobies Gram négatif et positif par le système Biolog est possible grâce à l'utilisation de plaques

GEN III.

Elles permettent de vérifier simultanément la réaction métabolique des bactéries en regard de

94 réactions phénotypiques (71 sources de

carbone et 23 tests de sensibilité aux inhibiteurs chimiques). À la suite de l'inoculation d'une plaque GEN III avec une bactérie inconnue, un profil métabolique est obtenu.

INOCULATION DE LA PLAQUE BIOLOG

Les colonies bactériennes isolées des tissus végétaux présentant les caractéristiques morphologiques des bactéries recherchées sont mises en culture pure sur le milieu TSA (Tryptic

Soy Agar).

La première étape est la préparation d'une suspension bactérienne dans un tube de liquide d'inoculation (IF) de type A (Vert). La suspension bactérienne doit avoir une transmittance de 90 à 98
La turbidité de la suspension bactérienne est mesurée par un

électrophotomètre ou un

turbidimètre.

L'inoculation de la plaque GEN III se fait en

déposant 100 µl de la suspension bactérienne dans chacun des puits. L'incubation se fait dans une chambre humide à 30 o

C pour une durée de

24 à

48 heures.

Les colonies de Pseudomonas sur le milieu

B de King ont une coloration blanchâtre à

crème avec ou sans la présence d"une fluorescence lorsque les colonies sont soumises à une lumière ultraviolette.

IDENTIFICATION

Les colonies de

Xanthomonas sur le milieu

LPGA ont une coloration jaune pâle à jaune

citron. Elles sont légèrement convexes, luisantes, avec une marge bien définie.

Laboratoire de diagnostic en phytoprotection

- MAPAQ - 2 -

LECTURE DE LA PLAQUE BIOLOG

L'identification des bactéries par le système Biolog est réalisée grâce à un lecteur de plaque automatique jumelé à une banque de données informatique contenant le profil de bactéries de référence. Le puits A1 doit être incolore. L'utilisation des substrats ou la résistance aux inhibiteurs chimiques par la bactérie se traduit par l'apparition dans les puits d'une couleur pourpre.

Cette coloration pourpre est produite par la

réduction de l'indicateur, le tétrazolium, en un composé coloré le formazan . En l'absence de l'utilisation du substrat ou si la bactérie est sensible au produit, le puits demeure incolore.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

Suite à

la lecture des résultats des tests biochimiques obtenus pour la bactérie inconnue, le système d'identification Biolog compare ce profil métabolique à ceux des bactéries de référence de sa base de données. L'identification est donc réalisée en jumelant le profil de la bactérie à identifier à celui de l'espèce bactérienne présentant le plus de similarité.

L'identification s'appuie principalement sur deux

valeurs (figure 2) : La similarité est un indice reflétant le degré d'appariement entre le profil métabolique de la bactérie à identifier et celui de la bactérie proposée par le système Biolog. Plus la valeur se rapproche de 1, meilleure est considérée l'identification.

La distance indique le nombre de puits dont

les résultats sont différents entre la bactérie inconnue et celle proposée par le système

Biolog. Plus cette différence se

rapproche de zéro, meilleure est considérée l'identification.

Vous retrouverez ce document sur le site

Agrireseau.qc.ca

Mise en page du document par Alexia Lavigne,

étudiante en technique de Bureautique

- Cégep

Garneau et Carolle Fortin, technicienne en

administration - Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, MAPAQ

Québec, le

21 juillet 2014

MAPAQ Plaque GEN III inoculée avec une bactérie inconnue et incubée

24 heures à 30

o C.

Laboratoire de diagnostic en phytoprotection

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