[PDF] Production et caractérisation de lamylopullulanase de la levure

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Par Scheherazed DAKHMOUCHE-DJEKRIF

Thèse présentée en cotutelle

pour l'obtention du grade de Docteur de l'UTC Production et caractérisation de l'amylopullulanase de la levure Clavispora lusitaniae ABS7 isolée de blé cultivé et stocké en zones arides

Soutenue le 4 janvier 2016

Spécialité : Biochimie et Biologie Moléculaire et Cellulaire : Transformations intégrées de la matière renouvelable (EA 4297) D2258 1

Devant le jury :

Président

Mr KHELIFI Douadi : Professeur Université Frères Mentouri Constantine. Algérie.

Rapporteur Mr BOUSSEBOUA Hacène

Rapporteur Mr HADJ SASSI Abdessattar: Maître de Conférences Bordeaux (INP), (ENSCBP), France. Examinatrice Mme COCHET Nelly : Professeur, Université de Technologie de Compiègne, France.

Direct

rice de Thèse Mme MERAIHI Zahia: Professeur, Université Frères Mentouri Constantine, Algérie

Co-directeur de Thèse Mr PAUSS André : Professeur, Université de Technologie, Compiègne, France.

Co-directrice de thèse Mme GILLMAN Louisa

2

Je tiens à remercier en premier lieu Dieu, le

volonté et patience pour achever ce travail.

Ce travail a été réalisé en co-tutelle entre la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de

Je tiens à adresser mes remerciements les plus sincères à Madame le Professeur Meraihi Zahia, mon

promoteur, pour toute son aide, sa patience, son soutien et merci aussi pour ses critiques constructives et avisée res remerciements au Professeur André Pauss pour avoir

Compiègne

Mes vifs remerciements vont à Mme Gillmann Louisa, Maître de Conférences et Directrice de

co-

sein de son laboratoire. Merci pour son encadrement, ses encouragements, son soutien dans les

Je remercie également Monsieur Khelifi Douadi, Professeur à la faculté des Sciences de la Vie et de

la N

Technologie de Compiègne. Je la remercie surtout pour son soutien et son aide précieuse dans mon

e C cette lourde charge en examinant ce travail et de nous honorer par sa présence Je remercie très sincèrement Professeur Hacène Bousseboua, Directeu de Constantine boration scientifique et amicale et sa gentillesse. Merci Monique pour tous ces fois. Je souhaite aussi remercier vivement le Professeur Bouchara Jean Philippe, Professeur au Laboratoire de Parasitologie Laboratoire GEIHP (Groupe issures et des levures. Il a mis à ma disposition le matériel et les produit s chimiques nécessaires pour la réalisation de mon travail. Je le remercie pour son aide, ses conseils, sa gentillesse et son équipe, pa rticulièrement Julia et Danielle.

3 Mes remerciemen Arnaud Dudoit, Responsable du Service

Micropolluants du Laboratoire Hydrologie et d'Hygiène dé dans la partie

statistique et pour la lyophilisation du jus de fermentation, Mes remerciements vont à Madame Noémie Jacques, Responsable de qualité CIRM Levures au

CNRS de Grignon - pour

lpar la biologie moléculaire des levures sélectionnée par les tests classiques de fermentation ainsi que pour la réalisation des photographies de spores. Je remercie Monsieur Benoit Colonna Ceccaldi et Monsieur Laurent

Attard

du

Centre

de Recherche Pernod-Ricard au Laboratoire de Technologie du Vivant fourni le besoin.

Je remercie Monsieur El Hourch Mohamed pour

analyses sur la composition chimique du lactosérum. leur gentillesse surtout Pascal.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude pour tous les enseignants de la Faculté des Science de la

Nature et de la Vie

formation. Je remercie particulièrement mon amie Madame Bennammoun ensemble durant toutes ces années. s ensemble.

Je remercie notre ex-ingénieur du Laboratoire Mr Ziada Abderazak pour avoir été toujours là quand

besoin de lui. Je remercie, aussi toute notre équipe du laboratoire pour leur aide : Monsieur Nouadri Tahar,

Madame Me

ziani Zohra, Madame Ait Kaki Amel, Madame Labbani Fatima-Zohra Kenza et

Monsie

ur Merouane Fateh. -alimentaies pour son aide pour la partie statistique et aussi pour les graphes et les figures. Je collègues du Département des Sciences de la nature et de la vie. Je remercie, aussi, tous mes collègues de la promotion de magister de 1997. ment, mes remerciements à ma petite famille : mon époux Mohamed et mes trois chers enfants, Abdelhak, Adel Amir et lyes qui ont beaucoup pris sur eux pendant mon absence, 4 Le 5

Quiconque, s, verra le ciel petit

(Philosophe chinois)

6 Į

Į-amylase et pullulanase) thermostables

par des levures contaminant le blé récolté dans des zones semi arides et arides (Biskra - Sahara, Sud Algérien)

et Į-1- Į-1-

térêt industriel. Après isolement et caractérisation de colonies levuriennes, la

méthode de plate-test- plus performante dans la production enzymatique parmi une douzaine dĮ-

morphologiques, les tests biochimiques et la biologie moléculaire a permis de répartir la population comme

suit : 50% Clavispora lusitaniae (forme anamorph Candida lusitaniae), 25%, Pichia guilliermondii, 8%

Pichia carribbicca, 8% Meyerozyma guilliermondii et 8% Rhodotorula rubra. Par sa richesse en amidon, le

biotope du blé est favorable à la survie des levures amylolytiques. La majorité de ces souches dont la souche

L7 es

t productrice de pseudo ou vrai mycélium et est tolérante à certains paramètres comme la température, la

salinité, les stress osmotique et éthanolique. La souche de levure L7, Clavispora lusitaniae ABS7, semble être

Clavispora lusitaniae

(L5, L9, L10, L11 et L12) présentent une seule bande.

En conditions optimales (agitation 136,56 rpm, température54,14°C, amidon 2,66g/l, extrait de levure

0,365g/l, sels 8, 75ml/l et oligo-éléments 4,3ml/l en erlenmeyers de 250 ml), la production maximale atteint

les valeurs suivantes : 13456,36±300 UI pour Į-amylase et 12611, 6±154 UI pour la pullulanase. Ces

performances sont en accord étroit avec la prédiction du modèle statistique évaluée à 13231UI pour

Į-a

mylase et 12825,5 UI pour la pullulanase. La production optimisée a pratiquement doublé par rapport à la

-amylase et 6308,5 UI pour la pullulanase). En conditions

optimales et en fermenteur de 2 L, la production maximale pour les deux enzymes de la levure Clavispora

lusitaniaeABS7 est obtenue au bout de 28 h avec un optimum de croissance obtenu à 40 heures. La production

s associée à la croissance. La production maximale des deux enzymes

à pH 8.

paroi du fermenteur, probablement un exo-polysaccharide. Le profil chromatographique sur Séphacryl S200

révèle deux activités Į-amylasique et pullulanasique éluées en même temps que

DEAE-cellulose confirme la présence des deux activités dans la même fraction. Les deux enzymes sont donc

présentes sur l Į-amylase et la pullulanase sont purifiées avec un taux de purification de

50,5 et 44,6 respectivement et des rendements respectifs de 23,9% et 21,1%. une

seule bande sur le gel de SDS-PAGE avec un poids moléculaire estimé à 75KDa et une activité amylolytique

Į-amylasique (indépendante de Ca2+) et pullulanasique (une métalloenzyme à

calcium). La souche de la levure Clavispora lusitaniae ABS7 possède donc une enzyme amylolytique avec

deux sites actifs. La CCM révèle une en maltotriose, maltose et glucose, optimisation

Į-amylasique à 4907,75 UI (rendement 72,3 %) et celle de la pullulanase à 4491,83 UI (rendement

70,1%) avec un pH optimum de 8,5.

amylopullulanase type II libre de Clavispora lusitaniae ABS7 est thermostable et conserve 88% de son deux activités. Une incubation de 180 min

à 85°C a permis de conserver sensiblement la même activité résiduelle pour les deux enzymes: 94,33% pour

Į-amylase et 94,2 pour la pullulanase. Les performances des enzymes amylolytiques de cette souche de

levure (isolée d'un environnement saharien aride) la qualifient de souche d'utilité industrielle en particulier

et des détergents puisque les enzymes alcalothermostables

de Clavispora lusitaniae ABS7 ont démontré une excellente stabilité et une compatibilité avec les détergents

à lessive commerciales.

Į-amylase, pullulanase, levure, Clavispora lusitaniae optimisation, purification et immobilisation.

7 Į

This study aims to produce two amylolytic enzymes (Į-amylase and pullulanase) by thermostable

wheat contaminant yeast harvested in semi arid and arid zones (Biskra, Sahara, Algeria SUD) and capable of

hydrolyzing both the Į links 1-4 and 1-6 of polysaccharides such as starch and pullulan, molecules of

industrial interest. After isolation and characterization of levuriennes colonies, the test method of agar-plate allows to isolate amylolytic strains and show, that the L7 strain is the most effective, in the enzymatic

production of the 12 yeast strains producing Į-amylase and pullulanase the thermostable. The identification of

strains, based on morphological, biochemical tests and molecular biology has helped spread the population as

follows: 50% Clavispora lusitaniae (anamorph form Candida lusitaniae), 25%, Pichia guilliermondii, 8%

carribbicca Pichia, 8% Meyerozyma guilliermondii and 8% Rhodotorula rubra. By its high starch, the wheat

biotope is favorable to the survival of amylolytic yeasts. Most of these strains, including the strain L7,

is producer, pseudo or true mycelium and is tolerant to certain parameters such as temperature, salinity,

osmotic stress and ethanolic stress. The yeast strain Clavispora lusitaniae ABS7 (L7) seems to be the most

efficient in the production of thermostable enzymes. Its molecular identification showed two bands with the

endonuclease HAE III while other strains of the same species Clavispora lusitaniae (L5, L9, L10, L11 and

L12) have a single band. In optimal conditions (agitation 136.56 rpm, temperature 54.14 ° C, starch 2,66g / l,

yeast extract 0,365g / l, salts 8 75ml / l and trace elements 4,3ml / liter Erlenmeyer flasks into 250 ml), the

maximum production reached: 13456.36 ± 300 IU for the Į-amylase and 12611, 6 ± 154 IU for pullulanase.

This performance is in close agreement with the prediction of the statistical model 13231UI evaluated for

Į-amylase and 12825.5 IU for pullulanase. The optimized production almost doubled compared to production

before optimization (6639.16 IU for the Į-amylase and pullulanase for 6308.5 IU). In optimal conditions, and

2 L fermenter, the maximum production for the two enzymes of Clavispora lusitaniae ABS7 obtained after 28

hours, with an optimum of growth obtained at 40 hours. The production of both enzymes is thus not associated

with growth. The maximum production of both enzymes is obtained at pH 8. The kinetics are characterized by

an increase in carbohydrate and a substance spooning the wall of the fermenter, probably an exo-

polysaccharide. The chromatographic profile on Sephacryl S200 reveals two Į-amylase and pullulanase

activities eluted along with the protein peak. Elution DEAE cellulose confirms the presence of both activities

in the same fraction. Both enzymes are present on the same molecule. The Į-amylase and pullulanase were

purified with a purification rate of 50.45 and 44.59 respectively and respective yields of 23.88% and 21.11%.

The purified enzyme showed a single band on SDS-PAGE gel with a molecular weight estimated at 75 KDa

and an amylolytic activity containing both the Į-amylase activities (independent of Ca2+) and pullulanase (a

calcium metalloenzyme). The strain of the yeast Clavispora lusitaniae ABS7 therefore has an amylolytic

enzyme with two active sites. TLC reveals an enzyme which hydrolyzes starch into maltose and glucose and

pullulan into maltotriose, maltose and glucose, which shows that the saccharifying enzyme, and corresponds to

a pullulanase type II (amylopullulase). The optimization of the immobilization of the enzyme enabled the

improvement of the activity: Į-amylase to 4907.75 IU (yield 72.3%) and pullulanase to 4491.83 IU (yield 70,

1%) with a pH optimum of 8.5. It appears from our study that amylopullulanase type II free is thermostable to

heat treatment of 75 ° C for 3 hours of incubation, and retains 88% of its original activity. The immobilization

improved thermostability of the two activities. An incubation period of 180 min at 85 ° C made it possible to

retain substantially the same residual activity for both enzymes: 94.33% for Į-amylase and 94.2% for

pullulanase. The performance of the amylolytic enzymes of the yeast strain (isolated from an arid Saharan

environment) qualify the strain of industrial utility particularly in starch industries, textiles and detergents

since the alcalothermostables enzymes Clavispora lusitaniae ABS7 have demonstrated excellent stability and

compatibility with the commercial laundry detergents. : Į-amylase, pullulanase, yeast, Clavispora lusitaniae, optimization, purification and immobilization.

8 Ν΍Εϥ·ϭιΉ΍ιΥΓα΍έΩĮϝ΍ϡϷ΍ίϭϥϡΓέϱϡΥϝ΍ΓϝϭαωϡϥϡΡϡϕ

lusitaniaeˬ̃Pichia guilliermondiiˬ̃Pichia carribbicca ˬ 8̃Meyerozyma guilliermondiiϭ8̃

ϑήόΘϟ΍ϲΌϳΰΠϟ΍ΔϟϼδϠϟ L7Ϧϴτϳήηϊϣ endonuclease HAE III ϲϓϦϴΣϟ΍ΕήϬυ΃ΕϻϼδϯήΧ΃ϦϣβϔϧωϮϨϟ΍L5)

Sephacryl S200ϭ ϰϠϋDEAEίϮϠϴϠδϟ΍ΩϮΟϭρΎθϧΕ΍ΫΕΎϨϴΗϭήΑΎϔϟ΃ΰϴϠϴϣϷ΍ϱΔϓΎοϹΎΑήϬψϳςϘϓΪΣ΍ϭϦϴΗϭήΑϦϜϟ

2 + 9 17 18

Liste des 21

23
... 25

1.... 25

1.2. Taxonomie du 25

1.3. Caractéristiques des 25

1.3.1. Caractér 25

1.3.2. Caractéristiques 26

1.3.3. Caractéristiques 27

1. 27 28

1.3.3.3. Effet des facteurs de croissance et des oligo-.. 28

1.3.4. Caractéristiques 28

1.3.4.1. Effet de la température s 28

1.3.4.2.. 29

29
.. 30 . 31

1.5.1. Levures productric... 31

1.5.2. Système amylolytique chez les ... 33

33

2.1. Classification des .. 33

2.2. Structure des enzymes de la fa 34

2.3. Į 35

Į- 36

2.3.2. CaractéĮ-. 36

10 .... 36

2.3.2.2. pH ... 37

. 37 . 37 . 38

2.4.1. Définition et . 38

2.4.2. So. 38

2.. 38

2.4.2.2. Source . 38

2.4.3. Types de p... 39

2.4.4. Régulation de la production de la pullulanase .. 41

41
... 41 .. 41

2.4.6. Caract 41

2.4.6.1. .. 41

... 42 42

2.4.6.4. Minéraux et certains oligo- 42

43

2.5. Application industrielle de la pullulanĮ- 43

43

2.6.2. En industrie de la transformation de 43

2.6.3 44

44

2.6.5. 44

2 45

2.6.7. En industrie 45

11 2.6.8. Dans le diagnostique et en 45

2.6.9. Dans la production des gommes 46

. 46 ... 47

2.6.12. Dans .... 47

2.6.13. E 47

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