[PDF] Topo CNR MAT oct 2014 AV Réunion annuelle du CNR-

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Réunion annuelle du CNR-MAT

17 octobre 2014Le laboratoire ADAMTS13

du CNR-MAT

Agnès Veyradier

Service d"Hématologie biologique

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT

Groupe hospitalier Saint Louis-Lariboisière-F.Widal, site Lariboisière Paris

Expérience 1999-2014

du laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT (Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques)

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : historique

De la recherche clinique au diagnostic médicalTests phénotypiques pour les patientsInserm U143

Inserm U143

Hémato bio

Hôp. A. Béclère

1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014

Hématol bio

Hôp. A. BéclèreHémato bio

Hôp.

LariboisièreInserm U770

Tests génotypiques pour les patients1999

2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014

Inserm U143/U770

Génétique

Hôp. Hôtel-Dieu - CHU de Nantes

Réseau clinico-biologique des MATCentre National de Référence des MAT (PNMR)

2000 20022001 2003 20052004 2006 20082007 200920112010Nombre de tests ADAMTS13phénotypiques

1000

20003000

Soins courantsRecherche clinique

Labellisation

CNR-MAT

PNMR1

Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : activité

. Total sur 14 ans : environ 15 000 tests phénotypiques -> recrutement national -> 1 à 3 séries d"ADAMTS13 activité / semaine -> compte rendus spécialisés experts -> avis spécialisé (tel, email) dans 30% des cas

20122013

Filière MARIH

PNMR2

Exploration biologique

d"ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

II- Méthodes biologiques

. Activité d"ADAMTS13. Antigène d"ADAMTS13. Auto-anticorps anti-ADAMTS13. Gène d"ADAMTS13

I- Etapes pré-analytiques

. Etude phénotypique (activité, antigène, recherche d"auto-Ac)-Plasma citraté ou serum -Si absence de ttt extemporané : congélation à -20C ou -80C -Si ttt sur un site extérieur, envoi dans la carboglace -Limites : communes à toutes les techniques . EDTA : inactivation d"ADAMTS13 in vitro . Hémolyse : inactivation d"ADAMTS13 in vitro propres aux méthodes VWF full-length . Taux de VWF:Ag > 300 UI/dl propres aux méthodes fluorimétriques . Autofluorescence de certains plasma/serum ? . Hyperbilirubinémie . Etude génétique- Sang total EDTA ou citraté conservés à +4C pdt 72 h ou -20C - Consentement éclairé du patient

Exploration biologique d"ADAMTS13

PrincipeDégradation d"un substrat exogène (VWF full-length ou courts peptides de VWF) par l"ADAMTS13 du plasma testé. Les produits de dégradation du VWF clivé par ADAMTS13 sont mesurés par des techniques : - électrophorétiques ( multimères ou fragments) - immunologiques ( CBA , VWF:Ag , Chr-VWF73 - d"agrégation plaquettaire (VWF:RCo) - fluorimétriques (FRETS-VWF73)- de spectrométrie de masse (SELDI-TOF)

Normes :

50 - 150 %

ObjectifDétection des déficits fonctionnels sévères: activité d"ADAMTS13 <10%

Mesure précise des taux d"ADAMTS13 entre 11% et 100%II- Méthodes biologiques : Activité d"ADAMTS13 (1)

Exploration biologique d"ADAMTS13

Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)

Multimères du VWF (SDS-agarose)

Mesure de l"activité d"ADAMTS13

Furlan et al, NEJM 1998

Dilutions

plasmatiques1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Tp 1/20 1/40 1/80 1/160 1/3201/640

Sujet normal

Activité d"ADAMTS13 100%

Patient PTT

Activité d"ADAMTS13 <10%

Méthodes immunologiques (VWF full-length)

ELISA VWF:Ag

Mesure de l"activité d"ADAMTS13Obert et al, Thromb Haemost 1999

Sujet normalPatient PTT

Plasma

+ BaCl 2 rvWF WT (substrat) +

Protéolyse

Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA

Acm anti-vWF

C-term

Acm anti-vWF

N-term

ou

Méthode Fluorimétrique (VWF-73)

FRETS-VWF73

Mesure de l"activité d"ADAMTS13Kokame et al, Br J Haematol 2005

Evaluations menées par le laboratoire ADAMTS13

du CNR-MAT en 2013-2014

EVALUATION DE 2 KITS COMMERCIAUX

. Projet initial Evaluation en parallèle du kit Genprobe

®et du kit Technoclone

mais rupture de stock du kit Technoclone

®pendant 6 mois

. Finalement . Evaluation du kit Genprobe

®début 2013

Thouzeau-Benghezal S, Capdenat S, Stepanian A, Coppo P, Veyradier A. Thromb. Haemostasis 2013. Evaluation du kit Technoclone

®fin 2013-début 2014

Joly B, Stepanian A, Hajage D, Thouzeau-Benghezal S, Capdenat S, Coppo P, Veyradier A. Thromb. Research,

2014. NB : auto-financement des réactifs (pas de conflit d"intérêt)PARTICIPATION AU STANDARD INTERNATIONAL . (NIBSC, United Kingdom) sous l"égide du SSC VWF/ADAMTS13 de l"ISTH

. Très bons résultats

Equipe ADAMTS13

Hôpital Lariboisière, Paris

Dr Alain StepanianMlle Sophie Capdenat Mme Sandrine Benghezal

Mme Sylvaine Savigny

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