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UNIVERSITE DE LIMOGES

Ecole Doctorale Sciences Biologiques et Santé (ED n° 615)

UMR CNRS 7276 INSERM U1262

Thèse pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE LIMOGES

Discipline : Biologie Science Santé

Spécialité : Immunogénétique

Présentée et soutenue par

HEND BOUTOUIL

Le 12 septembre 2018

tude des voies de réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la recombinaison suicide du locus IgH en physiologie normale et pathologique du lymphocyte B Thèse dirigée par Sophie PÉRON et Michel COGNÉ JURY Rappo rteurs

Dr Gaëlle LEGUBE

Pr Pauline

SOULAS-SPRAUEL

Examinateurs

Dr Sophie PÉRON

Pr Michel COGNÉ

Thèse de

doctorat 2 Durant mes trois années de thèse, j'ai bénéficié d'un contrat doctoral avec la faculté de Médecine de Limoges. 3

Remerciements

Je remercie tout d'abord les membres de mon jury de thèse, mes deux rapporteurs, le Dr LEGUBE et le Pr SOULAS-SPRAUEL qui ont accepté et fait le déplacement de Toulouse et Strasbourg. Je remercie mes directeurs de thèse, Sophie et Michel. Merci Michel de m'avoir accordé l'opportunité de vivre cette expérience scientifique et humaine au sein d e votre

équipe

. Sophie, je tiens à te remercier pour ton encadrement depuis le stage de M2 jusqu'à la fin de ma thèse. J'ai apprécié de travailler sur ce projet complexe et original à la fois. Je ne m'enfais pas pour la personne qui prendra le relais, elle aura la chance d'être soutenue et motivée en cas de besoin Je souhaite remercier mes chers collègues bien évidemment ! Merci pour tous c es moments passés à vos côtés, les bons et les mauvais ! Je pense en premier à mes collègues exclusivement féminin es du bureau n°107 : Iman, Zeinab, Audrey, Julie.

Grâce à vous, la bonne

ambiance était au rendez-vous et le risque de tomber en hypoglycémie réduit à " 0 ». Je n'oublie pas les anciens du bureau, Brice, Nicolas et Mylène, mais aussi Racha et Héloïse, pour votre bonne humeur légendaire Je tiens à remercier mes voisins du deuxième étage, à qui je rends souvent visite pendant les temps d'incubation. Je pense surtout au duo Omar/Jean-Marie avec qui on trouve toujours de quoi rigoler. La liste est très longue alors pour ne pas m'étendre et ne vexer Péronne, je dis un sincère GRAND MERCI à toutes les personnes que j'ai côtoyé au sein de ce laboratoire 4

Résumé

La rencontre des lymphocytes B matures avec l'antigène (Ag), au niveau des organes lymphoïdes secondaires, déclenche la maturation terminale, au cours de laquelle deux évènements peuvent avoir lieu : la commutation de classe de l' immunoglobuline (CSR pour Class Switch Recombination) et l'hypermutation somatique (SHM). Dernièrement, notre laboratoire a décrit pour la première fois la recombinaison suicide du locus IgH (LSR pour Locus Suicide Recombination) (Péron et al., 2012). Cette recombinaison engendre une délétion totale de l'ensemble des gènes constants du locus IgH, empêchant ainsi l'expression d'Ig, et donc l'absence du récepteur BCR (B Cell Receptor). La cellule B se retrouve privée des signaux de survie délivrés par ce récepteur, et est induite à l'apoptose. La LSR semble opérer par les mêmes étapes que la CSR : 1- la transcription de régions de l'ADN ciblées, 2- la génération de cassures double brin (CDB) à partir de lésions introduites par AID (Activation-induced cytidine d eaminase), 3 - la réparation de l'ADN lésé majoritairement par le système classique de ligation des extrémités non homologues (C-NHEJ). Cependant, la réparation au cours de la LSR n'a pas été pleinement décrite, et sa détermination constitue l'objectif principale de mon doctorat. Dans un premier temps, nous avons mis au point un programme bio- informatique " CSReport », afin d'analyser la masse de données générées par le séquençage haut débit de jonctions du locus IgH (CSR et LSR) (Boyer et al., 2017). Cet outil nous a permis d'étudier le système de réparation des CDB, à travers la détermination de la structure au point de jonction. De façon inattendue, nos résultats montrent que la réparation de l'ADN dans la LSR est similaire entre la souris et l'Homme et si la CSR fait intervenir le C -NHEJ, la LSR semble faire appel à l'A-EJ (Alternative End Joining) et/ou la HR (Homologous Recombination). Ces observations sont renforcées par les résultats mettant en évidence une différence de l'association de protéines de réparation, ainsi que des marque s épigénétiques particulières entre les segments concernés par la CSR et ceux ciblés par la LSR chez la souris. Nous nous sommes ensuite interrogés sur la LSR dans le lymphome de Hodgkin (HL pour Hodgkin lymphoma), car l'absence de BCR à la surface des cellules de Reed Sternberg pourrait provenir de cet évènement. Les résultats de séquençage 5 haut débit révèlent une réparation différente au cours de la LSR entre le

HL et le

contrôle (amygdales saines) ce qui nous laisser stipuler que des altérations intrinsèques aux systèmes de réparation de l'ADN dans les cellules tumorales sont en cause. Globalement, nous avons développé " CSReport », un outil qui nous permet d'analyser la structure de réparation de l'ADN en partie, et de montrer une réparation similaire des CDB entre la souris et l'Homme et une différence de réparation de l'ADN entre la recombinaison CSR et LSR. De plus, nous avons mis en évidence une altération de la réparation dans des échantillons de lymphomes B (HL et CLL) comparé

à des contrôles (amygd

ales saines).

Mots clés :

Recombinaison suicide / Recombinaison isotypique / Locus IgH / Réparation de l'ADN / Lymphomes B 6

Abstract

Mature B lymphocytes meeting with antigen (Ag) inside secondary lymphoid organs activates their terminal maturation, with occurrence of class switch recombination (CSR) and somatic hyper mutation (SHM). Recently, our laboratory described for the first time

IgH locus suicide

recombination (LSR) (Péron et al., 2012). This process removes the whole constant genes of the locus, preventing Ig and BCR (B Cell Receptor) expression. The B cell is devoid of survival signals delivered by its receptor and is induced to apoptosis.

LSR seems to operate with same molecular steps as

CSR : 1- transcription of

targeted DNA regions, 2 - generation of double strand breaks (DSB) from DNA lesions induced by AID (Activation-induced cytidine deaminase), 3- DNA repair by classical non homologous end joining (C-NHEJ) pathway. However, DNA repair during LSR was not fully understood, and this is the principal objectif of my PhD studies. First, we developped a bioinformatic program " CSReport », to analyse high throughput sequencing (HTS) datas of IgH locus junctions (CSR and LSR) (Boyer et al., 2017). This tool allowed us to study the DSB repair systems, through determination of the structure at the junction site. Unexpectedly, our results show that DNA repair in DNA during LSR is similar between mice and human, and if CSR implicates C-NHEJ, LSR seems to invlove Alternative end joining (A-EJ) and /or homologous recombination (HR). These observations are consolidated by results showing a difference in the association of repair proteins, and in particular epigenitic marks between DNA segments concerned by CSR and those targeted by LSR in mice. We asked ourselves about LSR in HL, because BCR absence on its Reed Sternberg cells surface may be a result of this recombination. HTS results reveal a different repair during LSR between HL and the control (healthy tonsils), which let us stipulate that alterations in DNA repair systems of tumoral cells are the cause.

Globaly, we developped "

CSReport », a tool which permits us to study DNA repair structure in a part, and to show a similar DSB repair systems between mice and human, and a difference between CSR and LSR repair. Furthermore, we sh ow an alteration in DNA repair of B lymphoma samples (HL and CLL) compared with the control (healthy tonsils). 7

Key words:

Suicide recombination / Class switch recombination /

IgH locus / DNA repair / B

lymphoma 8

Liste des abréviation

s A

ADN Acide DésoxyriboNucléique

AID Activation-induced cytidine

deaminase

Ac Anticorps

Ag Antigène

A-EJ Alternative End Joining

AML Acute myeloid leukemia

ALL Acute Lymphoblastic Leukemia

ARN Pol II

ARN Polymérase II

APE1 Endonucléase AP1

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated

alpha

ADNsb ADN simple brin

ADNdb ADN double brin

B BER

Base Excision Repair

B-NHEJ Back-up NHEJ

BCR

B Cell Receptor

53BP1

53 binding Protein 1

BRCA1 BReast Cancer1

BSAP

B Specific Activator Protein

C

CTCF CCCTC-binding factor

ChIP Chromatin Immunoprecipitation

CSR

Class Switch Recombination

CDR

Complementarity Determining

Region

C Cytidine

CSB Cassure simple brin

CDB Cassure double brin cHL Classical Hodgkin's Lymphoma

CLL Chronic Lymphocytic Leukemia

CML Chronic myeloid leukemia

C-NHEJ Classical Non-Homologous

End Joining

Chk Checkpoint Kinase

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