An Introduction to Gel Permeation Chromatography and Size
HPLC – high performance liquid chromatography in which the mobile phase is forced chromatography products for the analysis and purification of biomolecules.
Cours de Chromatographie
Chromatographie en Phase Liquide (HPLC). Phase mobile. Chromatographie en Phase Liquide (HPLC). Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). Appareillage.
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Comment lire un chromatogramme HPLC ?
La quantification des composé analysés en HPLC se base sur les pics visibles sur le chromatogramme. Le paramètre utile pour la quantification est soit l'aire du pic, soit la hauteur du pic. De manière générale, la quantification est préférée en utilisant l'aire du pic plutôt que sa hauteur.Comment lire un chromatographe ?
Interprétation du chromatogramme
1Si la substance analysée présente une seule tache alors il s'agit d'un corps pur (constitué d'une seule esp? chimique)2Si la substance analysée présente plusieurs taches alors il s'agit d'un mélange (constitué de plusieurs esp?s chimiques)Quel est le principe de la chromatographie HPLC ?
Le principe de la HPLC est, comme pour les autres variantes de chromatographie, d'utiliser les différences de propriétés physico-chimiques de différents composés pour les séparer. Un liquide, l'éluant, constitue la phase mobile, qui va entraîner plus ou moins facilement les molécules du mélange.- Le terme C18 correspond à un greffage d'une chaîne carbonnée de 18 carbones (CH2)17-CH3 sur le gel de silice. Les phases stationnaires C8, un peu moins apolaires sont également très largement utilisées. Toutefois , le colonnes fonctionnant en mode HILIC permettent désormais de séparer des composés polaires.
![NOTIONS FONDAMENTALES DE CHROMATOGRAPHIE NOTIONS FONDAMENTALES DE CHROMATOGRAPHIE](https://pdfprof.com/Listes/17/30948-17chromato1.pdf.pdf.jpg)
NOTIONS NOTIONS
FONDAMENTALESFONDAMENTALES
DE DECHROMATOGRAPHIECHROMATOGRAPHIE
MariePaule Bassez
http://chemphys.ustrasbg.fr/mpbPLAN1. Introduction
2. Grandeurs chromatographiques
2.1 Rapport de distribution K du soluté 2.2 Thermodynamique de la chromatographie
2.3 Temps de r
étention du soluté2.4 Facteur de r
étention2.5 Facteur de s
électivité ou de séparation2.6 Courbe de Gauss 2.7 Résolution des pics2.8 La th
éorie des plateaux2.9 La th
éorie cinétique2.10 Exemple d'application
Bibliographie
1. Introduction
La chromatographie est une technique analytique qui permet de séparer les constituants d'un mélange homogène liquide ou gazeux. On distingue deux types de chromatographie: sur colonne et planaire.
ou stationnaire ou éluantou phase mobile mélange à s
éparerUne colonne est remplie avec une
phase stationnaire ou fixe.Une phase mobile, ou solvant
organique (ou mélange de solvants) ou é
luant, est introduite au sommet de la colonne et entraîne les constituants (ou solut
és) du mélange. Le solvant entra
îne les molécules de solut
és. Il existe une série de transferts entre les 2 phases.Les constituants du m
élange migrent avec des vitesses diff
érentes. Ils sont
élués (déplacés) et recueillis s
éparément, en solution dans la phase mobile, dans un détecteur de concentration.
Un chromatogramme pr
ésente des pics en fonction du temps.
Fig.Chromatographie
d'élution sur colonneou détecteur détecteurFig. Séparation des constituants d'un
mélange par chromatographie
d'élution sur colonne. Ref. D.A. Skoog et http://www.unige.ch/cabe/chimie_anal/chromato.pdf
Classement des méthodes de chromatographie sur colonne1. La chromatographie en phase liquide, CPL: la phase mobile est un liquide.
2. La chromatographie en phase gaz, CPG: la phase mobile est un gaz.
3. La chromatographie en fluide supercritique, CFS: P. M. = fluide supercritique.
Chromatographie en phase liquide
phase stationnairetype de séparationCLL Liquide fix
é sur un solide Partage entre liquides non misciblesCLPgreff
ée Groupemt org. lié chimiquement à un gel Partage entre liq. et surface grefféeCLSSolide ou gel Adsorption
CLG Liq. ds les pores d'un gel de polym
ère réticulé Partage/Tamisage(sieving) (Chr. liquidegel; perm éation; size exclusion)C.Ionique Polym ère organique réticulé greffé Echange d'ionsC.Affinit
é Support greffé porteur d'ions (IMAC) Liaison donneuraccepteurElectroC gel de silice ou polym
ère organ. greffé Mobilité ds champ électr.2. Grandeurs chromatographiques
2.1 Rapport de distribution K du soluté(rappel: soluté= corps minoritaire dans un solvant; corps simple = entité moléculaire formée d'atomes identiques: ex. O2; corps compos
é = entité moléculaire formée d'atomes différents: H2O; corps pur = corps form é d'entités moléculaires identiques ).Les séparations chromatograph. sont basées sur la répartition des solutés dans deux phases: solut
é A (phase mobile) ↔ soluté A (phase stationnaire)La constante d' équilibre de cette réaction est appelée: rapport de distribution KC'est le terme recommand
é par l'UICPA ( Union Internationale de Chimie Pure et Appliqu ée) depuis 1993 au lieu de constante de distribution, coefficient de distribution et coefficient de partage encore utilisés.K est
égal au rapport des concentrations du soluté A dans les deux phases:KA = [A]stat / [A]mob [A]stat = concentration en mol.L1 du soluté dans la phase stationnaire = [A]S
ou [A]org conc. dans la phase organique greff ée sur un support.[A]mob = ......phase mobile = [A]M2.2 Thermodynamique de la chromatographie
Les relations de la thermodynamique s'appliquent aux équilibres de distribution. solut é A (phase mobile) ↔ soluté A (phase stationnaire)KA = [A]stat / [A]mobΔG° = RT. ln K
ΔG° =
ΔH° TΔS°
de la valeur de K on déduit ΔG°, ΔH° et TΔS°
Les trois fonctions sont < 0. La r
éaction est spontanée. ΔS° <0 : l'entropie diminue quand le constituant quitte la phase mobile pour se
fixer sur la phase stationnaire.Equation de van't Hoff: dlnK / dT =
ΔH° / RT2
permet de calculer l'effet de la température sur le temps de rétention.
tR tM temps signal du détecteur 2.3 Temps de rétention du solutéFig. Courbe d'
élution ou Chromatogramme d'un mélange à 2 constituantsLe pic de gauche correspond au solut é qui n'est pas retenu par la phase stationnaire et qui atteint le détecteur à la même vitesse que celle de l'éluant. Son temps de rétention tMest le temps n
écessaire pour qu'une molécule de la phase mobile traverse la colonne. tM=temps mort = t0 = temps nécessaire pour que le pic d'un constituant non retenu par la PS apparaisse (retention time of an unretained peak or solvent front).
tR = temps de r étention d'un constituant retenu par la PS (retained peak) = temps écoulé entre l'injection et le moment où le constituant sort de la colonne. t'R = tR tM = temps de rétention réduit ou corrigé (adjusted retention time) v = L / tR = vitesse moyenne de d éplacement du soluté (L=longueur de la colonne) u = L / tM = vitesse moyenne des molécules de la phase mobile (cm.s1).
v = u.f (fraction de temps passé par le soluté dans la phase mobile) VM = V0 = volume de la PM dans la col. = vol. interstitiel accessible (=vol. mort).
Il est mesur
é par introduction d'un soluté non retenu par la PS. VM = tM . D D est le d ébit de la phase mobile (flow rate) c'est un volume par unité de temps: cm3.s1 ou mL.s1
u = D / S (S= section de la colonne) ( cm3.s1/cm2). VS = volume de la PS = V (colonne vide) VM VR = volume d' élution ou de rétention du soluté = volume de la PM nécessaire pour entraîner le soluté jusqu'à la sortie de la colonne = V (P.M.) qui s'est écoulé entre le moment de l'injection et celui correspondant au sommet du pic. VR = tR . D
V'R = VR V0 = volume de r étention réduit du soluté (adjusted retention volume)Rem. d
éfinition du débit: quantité d'une grandeur, ici le volume, par unité de temps. d ébit d'information = quantité d'information transmise par unité de temps: baud=bit.s1 à 13,5% de la hauteur D'apr ès PRW Scott, Principle and Practice of Chromatography online textbook2 .4 Facteur de rétention
Un composé de masse mT se répartit en mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Si les conditions op ératoires ne changent pas, mM et mS restent constantes au cours de la migration dans la colonne. Leur rapport est indépendant de mT. Il est appelé facteur de r
étention (recommandé par UICPA) plutôt que facteur de capacité. Ce n'est pas une constante.
k'A = mS / mM = CS. VS / CM. VM = KA . VS / VM avec le rapport de phase = VM /VS : KA = . k'ASi K = 0, le solut
é migre aussi vite que le solvant; si K = ∞ le soluté reste sur la colonne.On d émontre: k'A = (tR tM ) / tM = t' R / tM (donc KA = . t'A / tM) rem. (2tMtM) / tM = 1 donc si tR < 2tM alors k'A < 1;élution très rapide, difficile à étudier. si k'A > 20 ou 30; dur
ée d'élution très longue.En HPLC, la s
éparation est optimale pour 2 < k' < 10 afin que le temps de passage des constituants ne soit pas trop long; k'=5=valeur "idéale". Le facteur de r
étention exprime mathématiquement la capacité plus ou moins grande de la colonneà retenir chaque constituant.
2.5 Facteur de sélectivité ou de séparation
= KB / KA = rapport de distribution du constituant B le plus retenu sur le rapport de distribution du constituant A le moins retenu (1er pic). KB = [B]S / [B]M et est toujours > 1 k'A = KA . VS / VM k'B = KB . VS / VM donc: KB / KA = k'B / k'A et = k'B / k'A = [(tR(B) tM) / tM ] . [tM / (tR (A) tM ) ] = t'R (B) / t'R (A) Le facteur de sélectivité exprime la position relative de 2 pics sur le chromatogramme. pour le solut é A: KA = [A]S / [A]M et ΔGA° = RT. ln KA enthalpie libre de dissolution du soluté A dans la phase stationnairepour le solut
é B: KB = [B]S / [B]M et ΔGB° = RT. ln KBΔGB° Δ
GA° = RT . (ln KB ln KA) = RT . (ln KB / KA) = RT . lnΔGB° Δ
GA° = RT . ln
= KB / KA = exp (ΔGA° ΔGB° ) / RT temps (min)tM4tR(A)
14tR(B)
19 facteur de rétention: k'A = (tR tM) / tM = t'R / tM = 10/4 = 2,5 k'B = 15/4 = 3,75 facteur de s électivité ou de séparation: = t'R (B) / t'R (A) = 3,75 / 2,5 = 1,5exemple tR tMexemple2.6 Courbe de Gauss
La largeur d'une courbe de Gauss est définie par ,,: écarttype = ½ largeur du pic à la hauteur des points d'inflexion, à 60,6% de la hauteur. = 2,35 = largeurà mihauteur = 4 =
1,7 = largeur mesurée à 13,5% de la hauteur = largeur à la base du picLes pics chromatographiques ont une allure gaussienneL'aire des pics est calcul
ée en assimilant le pic à un triangle. Fig. Courbe de Gauss du site: http://www.acnancymetz.fr/enseign/physique/CHIM/Jumber/Chromato/Chromato_gen.htm2.7 Résolution des pics
Facteur de résolution: R = 2 [tR (B) tR(A)] / [ (B) + (A)] Effet des facteurs de s
électivité et de rétention sur la résolution: R =[(N1/2 / 4 )] . [( 1) / ]. [k'B / (1 + k'B )] (1)
efficacit é sélectivité rétention Efet de R sur le temps de r étention: tR(B) = (16R2H/u).[ /( 1)]2. [(1+k'B)3/k'B2 ] (2) on d éduit: R1 / R2 = (N1/N2)1/2 et tR1(B) / tR2(B) = R12 / R22Une bonne s
éparation est un compromis entre une résolution suffisante des pics et un temps de s éparation raisonnable. tR (A) tR (B)La résolution est la grandeur qui caractérise l'aptitude d'un système chromatographique (colonne, solut
és, solvants) à séparer 2 solutés. Le but de la chromatographie est d'obtenir la meilleure r
ésolution dans le temps le plus court.Fig. S
éparation de 2 pics adjacentsLes pics sont r
ésolus pour R = 1,5
fig. d'après D.A. Skoog et http://www.unige.ch/cabe/chimie_anal/chromato.pdf. Fig. Effet du facteur de r
étention k'B sur le facteur de résolution R et sur le temps de rétention tR(B) k'B (sans unit
é)R/Q et tR(B)/Q'R/Q
tR(B)/Q' Leséquations 1 et 2 précédentes peuvent être réarrangées:R = Q. k'B / (1+k'B ) et tR(B) = Q' (1+k'B)3 / k'B2
Les courbes ont
été tracées avec Q et Q' cts. C'est l'influence de k' qui est évaluée indépendamment des autres termes. Il faut remarquer toutefois que Q' varie avec R. Rem. Les valeurs de k'B > 10 correspondent
à une faible augmentation de la résolution pour un temps de séparation plus long. Il vaut mieux les éviter. Les séparations sont optimales en général pour 2 < k'B< 10. En CPL, k' peut varier avec une modification de la composition du m
élange de solvants (en CPG avec la temp
érature). minimum k'B =2
Fig. Effet de la modification de la composition du solvant sur la séparation des solutés D'apr
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