[PDF] Étude des effecteurs de type RXLR de Plasmopara viticola pour la

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UNIVERSITÉ DE STRASBOURG

École doctorale 414 : Sciences de la Vie et de la Santé UMR 1131 SVQV Santé de la Vigne et Qualité du Vin

Maud COMBIER

Thèse dirigée par :

Dr. MESTRE Pere,

Rapporteurs :

Dr DECROOCQ Véronique,

Examinateurs :

Pr BAILLIEUL Fabienne,

Dr ZIEGLER-GRAFF Véronique,

2 3

À ma mère,

À mon grand-père,

passionné 4

Remerciements

Je tiens à remercier Mme Decroocq et M. Duplessis en tant que rapporteurs. es remerciements à Mme Baillieul et Mme Ziegler-Graff pour leur participation s. manuscrit. Je remercie également très sincèrement mon encadrant en 2015. Tu aé tout en tirant les au niveau des dead lines et des priorités

pour prendre réellement conscience de tout ce que mont apporté cette thèse et ton enseignement. Un grand

merci pour ton soutient infailli Un grand merci à Marie-Christine, tu as su rajouter

manip à découper des disques dans de toutes petites feuilles de vigne. Tu as jamais hésité à proposer ton

aide. Sans toi, je me serais écroulée

nombre !!! Ton absence sur cette dernière année fut difficile personnellement et je suis profondément

heureuse de ton retour aussi rayonnante. Je te souhaite beaucoup de bonheur à toi et ta joulie famille !!! Je

A.thaliana s e !

Je remercie les membres de mes comités de thèse, Philippe Hugueney, Isabelle Fudal et Julie Chong.

Merci pour vos conseils précieux au cours de ces trois années et pour votre disponibilité. Je remercie Sebastien la collaboration, vos conseils furent salutaires. Encore sur mon

premier effecteur, PSE2. Ton aide a été merveilleuse pour ma thèse, les VIGS, les immuno et les corrections !

Toujours positif et entrainant (même pour les bêtises au permanganate de potassium qui auront couté la vie

à un .

Je remercie financé mon séjour au Danemark. Je remercie Simona Radutoiu et les membres de son équipe accueillie

équipe internationale et motivée. Merci Jean-Baptiste pour ton aide et ton accueil, malgré ton accident, tu as

su trouver quelques moments pour partager ton savoir. Merci à vous, Christel, Manoj, Tank et Alexandra

! Merci 5

Je remercA. thaliana (qui

s dans ce manuscrit) et Jérôme Mutterer pour votre expertise en microscopie confocale.

Merci à Aline et Gwendal, vous avez été tous deux très motivés, toujours prêt à vous dépasser

grand sérieux. Je vous souhaite une bonne continuation pour vos études et votre future vie professionnelle,

quelle ! Encore félicitations pour vos très belles soutenances, ce fut un réel plaisir de vous encadrer.

Merci également à tous

grandes, vos dépannages, vos prêts, vos conseils, votre soutien, vos sourires et votre bonne humeur. Merci à

Raymos

pour ma gloutonnerie en Bentha et en vigne. Merci à Gisèle et à illustrations pour Pint of Science et la Fête de la Science. Merci aux membres e moi et mes manips en tout genre. Merci à Murielle Viaud, Eric Galiana, Olivier, Carine et agents pathogènes et de répondre à toutes mes questions concernant leur confort.

Je remercie la Tribu Entre-Colle-à-Rien qui a rendu la vie en Alsace, loin des miens, pleine de vie, de

rando et de raclette !

Un gros merci à

sur les manips, la politique, les galères a vie zéro-déchet, le froid (oui ça meule

ici !), le chaud, la pluie, les jeux, les clopes, le café, les repas végétariens, la récup, les Molkys,

mes documents/mail officielss rencontre entre non- permanents et des soirées Jeux INRAon finisse ensemble cette aventure Colmarienne en janvier, Un grand merci à mes collègues de bureau, Jean-e

dans ce mini bureau il y a trois ans ! Votre sincérité, votre humour, vos dépannages et votre patience ont été

des bouffée quotidiennes. Je ne le dirais pas tout haut, il ne faut pas exagérer, mais vous allez me

manquer ! Merci aux voisins, le fameux bureau des thésards (mais pas que) Isa, Lise, Thuy-Thanh, Lorène,

Mickael, Antoine, Myriam et Claire, plus loin aux extrêmes : Guillaume, Noémie, Amandine, Sophie, Camille et

Manue, et encore plus, perdue au loin, Rehana. Big up à tous ceux qui ont soutenue depuis que je suis

arrivée et courage Thuy-thanh pour la fin, profite bien de ton séjour en Allemagne. Trop de choses à dire

évidement, merci pour vos coups de pouces, les pauses clopes, vos papotages aux repas, vos conseils, les

6

ralages, vos gâteaux, tout tout tout ! Merci Lise pour ta poisse contagieuse ;) et pour Lara-LaVominette, elle

fut un réel soutien dans ces temps difficiles. Merci Isa pour ta motivation absolue, ta force est entrainante.

Éloïse, Marine et

sépare et nclus dans vos papoteries de filles Nos mercredis à chouchouter Hyalo tout en papotant me manquent, ça fait déjà un bout.

Nos soirées et nos aventures dans les montagnes vosgiennes vont me manquer (larmes, snif, re-larmes

et re-snif). e. En plus de vos semaines de séminaires et de votrs thésards toutes

filières confondues, des personnes merveilleuses. Je tiens à remercier Agathe pour ton amitié et ton aide. Je

tiens à remercier la team Auriculus S : Gabi la Sirène, Norman le Poète, Stefoune la Joie, , Nathan

Abyssal, Juan le Couillu ; votre compagnie en ligne et IRL était extra chacun notre tour, pour pouvoir se retrouver bientôt !! Je remercie aussi tous mes anciens collègues de de bons conseils e liberté formatrice pour la thèse. Merci Agnès, Ian, Lisou, Yukoko, Damien, Popo, Alice, Je-

Nam, Sylvain, Jéjé, Léo, Charline, Céline, Nicolas, Flo, Anto, Nassima, Hebert, Zerbib, Luiz, Anto, et tous les

autres, vous êtes trop nombreux ! Notre aventure, cette page de ma vie, me manque terriblement. Merci

de toute la paperasse concernant le brevet durant ces trois ans de thèse. Merci Hoai- -ART. Merci le Rézo . Je remercie La Recherche avant même de savoir lire si fière. Je remercie également ms pour mon absence si longue. Je

remercie Lily, Éric, Alicia, Tristan et Valoch pour votre soutien et vos retours à la réalité au cours de quelques

WE. Je remercie Jessica, Kevin et Bruno, pour votre soutien, votre aide administrativo-relou-notarienne. Vous

vous êtes accrochés vaillamment dans ces temps très difficiles. Finalement petite , , nous soutenons quasiment en même temps. Je suis fière de toi, pat été encore plus <3. 7 Je remercie mon doudou, accepté mon départ en Alsace, merci de construire un petit nid douillet en Ardèche avec tout plein de super coupins pendant ce temps-là. Merci quelques temps, pour vernir me soutenir sur Colmar et me rendre la vie plus facile. <3 Un grand merci à tous ceux qui ont aidé à la relecture débusquer

les fautes dans les moindres recoins !! (Et un presque-merci à la fille en trottinette, qui a permis de rendre

Marion super disponible). Oui, il restera toujours des fautes de thèse. Le Pr Éric Karsenti décrit la méthode scientifique comme " un

rationalité s pas forcement eu ces trois ingrédients avec moi tout au long de ma thèse, mais ne

dit- ? 8

Abréviations

°C : Celsius

ABA : acide abscissique

ADN ou DNA : acide désoxyribonucléique

ADNg : ADN génomique

ADNt : ADN de transfert

AOX1 : Alcohol oxidase 1

ARN ou RNA : acide ribonucléique

ARNi ARNsi : petits ARN interferents (small interfering RNA)

Avr : facteur ou gène

BAX : Bcl-2associated X

BFA : Brefeldin A

cDNA ou ADNc : ADN complémentaire cfu : Colony-forming unit cm : centimètre

Co-IP : Co-immunoprécipitation

CTPS : Comité Technique Permanent de la Sélection

DAB -diaminobenzidine

dNTP : désoxyribonucléide triphosphate

EHM : Extra Haustorial Matrix

EMBO : Organisation européenne de biologie moléculaire (European Molecular Biology Organization)

ETI : Immunité déclenché par les effecteurs (Effector-Triggered Immunity)

F : Farad

g : gramme

GA : acide gibbérellique

GEVES : Groupe d'Étude et de contrôle des Variétés Et des Semences

GFP : green fluorescent protein

GUS : -glucuronidase

9 h : heure HMM : modèle de Markov cache (hidden Markov model) hpa : heure post agroinfiltration hpi : heure post inoculation HR : réponse hypersensible (Hypersensitive response)

HSP : heat shock protein

INRA : Institut National de la Recherche Agronomique

JA : acide jasmonique

jpa : jours post agroinfiltration jpi : jours post inoculation

K : Kilo

Kb : Kilobase

KDa : Kilo Dalton

L : litre

LC-MS : chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (Liquid chromatography-

mass spectrometry) LRR : répetition riche en Leucine (Leucine Rich Repeat)

M : Mole par litre

Min : minute

MS : spectrométrie de masse (mass spectrometry)

ARNmi : micro ARN

mol : mole nm : nanomètre nt : nucléotide(s) N-ter ou C-ter : extrémité amino (NH2) ou carboxi (COOH) terminal

OIV : Organisation mondiale de la Vigne et du Vin

ORF : cadre ouvert de lecture (Open Reading Frame) PAMP : Motif moléculaire associé aux pathogènes (Pathogen Associated Molecular Patterns) PCD ou MCD : mort cellulaire programmée (Programmed Cell Death)

PCR : Polymerase Chain Reaction

PM : Poids moléculaire

10

PPV : Plum pox virus

PR : Pathogenesis-Related protein

PTI : Immunité déclenché par les PAMP (Pattern-Triggered Immunity)

PVX : Potato virus X

PVY : Potato virus Y

QTL : locus de caractères quantitatifs (quantitative trait loci) RBOHD : Respiratory burst oxidase homolog protein D PRR : Motif riche en prolines (proline rich region)

R : facteur de résistance

RE : réticulum endoplasmique

RFP : Red fluorescent protein

RISC : RNA-induced silencing complex

RNAse : ribonuclease

RNA-seq : RNA-Sequencing

ROS Reactive oxygen species)

Rpm : tour par minute (rotation per minute)

Rpv : gene de resistance à Plasmopara viticola (Resistance to Plasmopara viticola) RT : transcription inverse (reverse transcription) RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT-qPCR : Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction

SA : acide salicylique

SAM : sélection assistée par marqueurs

SC : souche Colmar

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SLIC : Sequence-and Ligation-Independent Cloning

Spp : species pluralis

Subsp : sous-espèce

TMV : Tabacco mosaic virus

TGN : réseau des trans-Golgi

UE : Union Européenne

UTR : région non traduite (untranslated region) 11

UPR : Unfolded Protein Response

UV : Ultra-Violet

V :Volt

VATE : Valeur Agronomique, Technologique et Environnementale

Vol : volume

W : Watt

: Ohm 12

Table des figures et tableaux

Contexte bibliographique

Figure 1 : Arbre phylogénétique simplifié des Vitacées.

Figure 2 : Cycle biologique de la vigne.

Figure 3 : Origine de la vigne et de la viticulture. Figure 4 : Importance de la production viti-vinicole en France. Tableau 1 : Listes des bioagresseurs de la vigne les plus fréquemment rencontrés.

Figure 5 : Cycle de développement de P. viticola sur la vigne avec une phase sexuée et une asexuée.

Figure 6 : Étapes du cyle asexué de Plasmopara viticola dans une feuille de vigne.

Figure 7 : Cycles de contamination de la vigne par P. viticola et diversité des symptômes occasionnés sur les

organes végétatifs.

Figure 8 : Déroulement de la colonisation intercellulaire de P. viticola sur Vitis vinifera cv. Müller-Thurgau.

Tableau 2 : Les 10 premières substances actives contre le mildiou utilisées en France. Figure 9 : Moyenne des traitements par parcelle en 2010 toutes maladies confondues. Figure 10 : Pression parasitaire du mildiou ressentie en 2010.

Figure 11 :

Figure 12 : Évolution de la proportion de résistance au fongicide de type CAA.

Figure 13 : Modèle simplifié de la comparaison des formes de résistance monogénique et polygénique.

Figure 14 : Pl en

France avec le nombre de races virulentes de Plasmopara halstedii sur ces gènes entre 1977 et 2004.

Tableau 3 : Facteurs de résistance au mildiou de la vigne identifiés.

Figure 15 : Rpv3 de Bianca.

Figure 16 : Introgression de résistance par rétrocroisements successifs6 Figure 17 : Diversité structurelle des récepteurs PRR. Figure 18 : Représentation schématique de la mise en place de la PTI.

Figure 19

Figure 20 : Structure protéique des effecteurs cytoplasmiques de type RXLR et CRN. Figure 21 : Structure des différents récepteurs NLR

Figure 22 :

Figure 23 : via le modèle de garde ou de leurre.

Figure 24 :

Figure 25 : Le modèle en zigzag illustre le rendement quantitatif du système immunitaire de la plante.

Figure 26 : Identification de couples de gènes R/Avr Figure 27 : tion des effecteurs RXLR putatifs de P. viticola Figure 28 : Critères de séléction des effecteurs RXLR candidats. 13 Chapitre 1 : Recherche de gènes de résistance au mildiou de la vigne Tableau 4 : Liste des effecteurs RXLR candidats sélectionnés pour le crible.

Figure 29 : Procédure utilisée pour identifier des vignes qui possèdent un gène de résistance

Tableau 5 : Liste des hybrides utilisés pour le crible. Tableau 6 : Liste des lignées de vigne utilisées pour le crible.

Figure 30 : Variabilité de la prVvMyba1.

Figure 31

Figure 32 ues de vigne exprimant les

effecteurs candidats Pv70.2 et Pv47. Figure 33 : Co-expression de Rpv1 et des effecteurs RXLR de P. viticola chez N. benthamiana.

Figure 34 : -GFP

Figure 35 : Schéma de la recombinaison de la construction dans la séquence présente dans le génome

de P. pastoris. Figure 36 : Vérification de la production de GFP par P. pastoris transformé. Figure 37 : N. benthamiana produite chez P. pastoris. Figure 38 : -GFP chez N. benthamiana produite chez P. pastoris.

Figure 39 : V. vinifera cv. Syrah.

rs RXLR candidats Figure 40 P. viticola sur N. benthamiana et N. tabacum

Figure 41 : Évaluation de la capacité de suppression de la HR de Inf1 par les effecteurs RXLR candidats de P.

viticola.quotesdbs_dbs23.pdfusesText_29

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