[PDF] TP de Méthodes Spectrales 1 mars 2018 Dosage du

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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Boudiaf-M'sila

Faculté des Sciences

Département de Microbiologie & Biochimie

Polycopié de Travaux Pratiques

TP de Méthodes Spectrales

Polycopié destiné aux Etudiants en 3ième Année Licence en Biochimie

Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine

Année universitaire : 2017-2018

Semestre : 6

Unité d'enseignement Fondamentale 2 (UEM 3.2): Techniques biochimiques et méthodes spectrales

Matière 2: Méthodes spectrales

Crédits : 6

Coefficient : 3

Objectifs de l'enseignement

Connaitre les différentes méthodes spectrales et leurs applications en analyse biochimique. Mode d'évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de

TP, examen de TD et de TP.

SOMMAIRE

TP n° 0 :

TP n° 1 :

TP n° 2 :

TP n° 3 :

TP n° 4 :

TP n° 5 :

TP n° 6 :

Consignes de sécurité et matériel de laboratoire...................................... Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie directe................................................................ Dosage du glucose par la méthode de Trinder (spectrophotométrie indirecte)... Dosage des protéines totales par la méthode du biuret............................... Dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford ...................... Dosage du cholestérol total par la méthode Enzymatique-Colorimétrique CHOD-POD ................................................................................ Dosage de triglycérides par la méthode Enzymatique-Colorimétrique GPO- POD ........................................................................................ Références bibliographiques............................................................ 1 9 18 24
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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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1. Consignes de sécurité

Par mesure d'hygiène, il est interdit de manger dans le laboratoire. Le port de la blouse 100% coton est obligatoire. La blouse doit être de longueur raisonnable et à manches longues. Les étudiants doivent toujours manipuler debout. Aucun objet ne doit encombrer les paillasses. Les tabourets ou les chaises doivent être rangés sous les paillasses afin de ne pas encombrer les allées. Pour chaque manipulation présentant un risque, le port des lunettes de protection et de

gants en latex est impératif. Les cheveux longs doivent être attachés derrière la tête.

Toute manipulation de produits chimiques présentant un risque doit être réalisée sous une hotte ventilée, avec vitres protectrices. Le pipetage à la bouche est interdit. Utiliser les propipettes. IL est interdit de regarder de près les récipients contenant des liquides en ébullition. Ne pas respirer le contenu d'un récipient pour l'identifier à son odeur. Reboucher tout flacon immédiatement après usage. Ne jamais prendre de produits solides avec les doigts, utiliser une spatule. Utiliser des verreries résistantes aux hautes températures (verrerie Pyrex) lorsqu'il faut chauffer. Éviter de faire subir des chocs thermiques à la verrerie (ne pas refroidir brutalement un récipient chaud). Les paillasses doivent être nettoyées au cours de la séance et laissées parfaitement propres et sèches en fin de séance. Il est impératif de se laver soigneusement les mains après manipulation. TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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Il est recommandé de ne jamais jeter dans les éviers de laboratoires, les produits à risque : Verser les solutions dans les flacons de récupération prévus à cet effet. Les pictogrammes de sécurité de produits chimiques doivent être connus.

Le SGH (ou en Europe " règlement CLP ») s'applique de façon obligatoire aux substances depuis fin 2010. Ce nouveau système comprend 9 pictogrammes. Baptisé " Système Général Harmonisé (SGH) » ou " Globally Harmonized System (GHS) », il a pour but d'uniformiser l'étiquetage des produits chimiques à l'échelle mondiale. Il est appliqué en Europe sous le

nom de " Règlement CLP ». Le système européen préexistant et le nouveau système SGH

cohabitent ainsi depuis le 1 er décembre 2010.

2. Connaissance des risques de produits utilisés

Il existe trois grandes catégories de dangers intrinsèques aux substances chimiques : les dangers physiques (risque d'explosion, d'inammation, etc.) ;

les dangers pour la santé (toxicité aiguë, lésion oculaire, toxicité pour la reproduction, etc.) ;

les dangers pour l'environnement (danger pour les milieux aquatiques). TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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3. Etiquetage de produits chimiques

La première information sur les dangers d'une substance chimique est fournie par l'étiquette sur laquelle doit apparaître au moins : le nom du produit ; des pictogrammes de danger ; des mentions de dangers (phrases H) ; des conseils de prudence (phrases P) ; une mention d'avertissement. Sur l'étiquette, peuvent aussi figurer des grandeurs physiques (densité, masse molaire, composition, etc.). L'image suivante donne l'exemple d'une étiquette d'acide chlorhydrique concentré. TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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Pictogrammes de danger

Ces schémas représentent des types de dangers particuliers. Ils sont notés SGHXX et sont présentés dans la figure suivante.

Mentions de danger (phrases H)

Les mentions de danger complètent les pictogrammes. Elles commencent toujours par la lettre H (pour Hazard = danger) qui est suivie d'un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre correspond à la catégorie de danger. H2XX : mentions de dangers relatives aux dangers physiques ; H3XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour la santé ; H4XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour l'environnement.

Conseils de prudence (phrases P)

Les conseils de prudence complètent également les pictogrammes. Ils commencent toujours par la lettre P (pour Prudence) qui est suivie d'un nombre à 3 chiffres. Le 1er chiffre correspond à la catégorie de conseil de prudence.

P1XX : conseils de prudence généraux ;

P2XX : conseils de prudence - Prévention ;

P3XX : conseils de prudence - Intervention ;

P4XX : conseils de prudence - Stockage ;

P5XX : conseils de prudence - Élimination.

TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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Mention d'avertissement

Sur l'étiquette figure une mention d'avertissement " Attention » ou " Danger » qui

indique le degré relatif de dangerosité. " Danger » est utilisé pour les dangers les plus

graves. Substances C.M.R. : Cancérogène, Mutagène, toxique pour la Reproduction Il existe une classification européenne de produits chimiques C.M.R. qui s'appuie sur des

résultats d'études animales et/ou humaines. La liste des substances C.M.R. évolue car tous les

produits n'ont pas été testés.Les composés C.M.R. doivent être stockés sous clé et utilisés en

respectant scrupuleusement les consignes de sécurité. Quelques exemples de substances C.M.R. : aniline, benzène, 1,3-butadiène, chlorure de cobalt (II), dichromate de potassium, mercure, phénol...

4. Premiers soins aux victimes d'accident

4.1. En cas de projection cutanée

Rincer la peau longuement et abondamment à l'eau claire jusqu'à ce que le produit soit

éliminé.

Attention, ne pas chercher à neutraliser les produits acides ou basiques.

4.2. En cas de projection oculaire

Rincer immédiatement et abondamment à l'eau froide.

Consulter systématiquement un ophtalmologue.

4.3. En cas d'ingestion accidentelle

En cas d'ingestion, rincer la bouche. Boire un verre d'eau. En cas d'inhalation de vapeurs (Eau de Javel, Brome...), amener la personne dans un endroit aéré. TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.

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5. Matériel de Laboratoire

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire

(SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie directe.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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1. Rappel : SPECTROPHOTOMETRIE D'ABSORPTION MOLECULAIRE UV/Vis.

La spectrophotométrie d'absorption moléculaire UV-visible est une méthode d'analyse très commune dans les laboratoires, basée sur la propriété d'absorption des radiations lumineuses par la matière, ou en d'autres termes l'interaction molécule/ rayonnement électromagnétique. Le domaine de longueur d'onde utilisable correspond au spectre visible :

400 (violet) à 800 (rouge) nm environ ou au proche ultraviolet (200 à 400 nm).

Cette méthode nécessite l'utilisation d'un spectrophotomètre et permet de caractériser des molécules, de déterminer des concentrations d'espèces chimiques en solution et par extension de réaliser des suivis cinétiques des réactions (chimiques et enzymatiques).

1.1. PRINCIPE DE LA TECHNIQUE :

Lorsqu'une solution est traversée par un rayonnement polychromatique, elle peut diminuer l'intensité des radiations à certaines longueurs d'onde: on dit alors qu'elle absorbe ces radiations. La mesure de la fraction d'intensité lumineuse absorbée à cette longueur d'onde permet de déterminer la concentration de la substance absorbante dans la solution étudiée.

REMARQUE : " Absorption et couleur »

De façon simplifiée, si une solution absorbe dans le visible, elle apparaît de la couleur complémentaire à la longueur d'onde absorbée (violet/jaune, bleu/orange, vert/rouge) comme illustré par le cercle chromatique suivant :

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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1.2. LOIS DE LA SPECTROPHOTOMETRIE :

Représentation d'une cuve

traversée par un faisceau incident d'intensité I0 Ȝ.

Un faisceau d'intensité It Ȝ

en émerge. Soit un rayonnement monochromatique (de longueur d'onde Ȝ) d'intensité incidente IȜ traversant une solution absorbante de longueur du trajet optique). Une partie de cette radiation incidente sera absorbée par la solution et l'autre sera transmise et son intensité est notée It Ȝ avec It Ȝ < I0 Ȝ. A fin de quantifier l'intensité de la radiation absorbée à une longueur d'onde Ȝ donnée, deux grandeurs sont introduites: la transmittance, notée TȜ et l'absorbance, notée AȜ: Ces grandeurs sont sans unité ; la transmittance est souvent exprimée en % : Si TȜ = 100 %, le milieu est parfaitement transparent et AȜ = 0 ; Si TȜ = 0 %, le milieu est parfaitement opaque et AȜ . L'absorbance AȜ est souvent appelée Densité Optique (D.O.).

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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Loi de Beer-Lambert :

Considérons une solution contenant une espèce chimique de concentration c absorbant à la longueur d'onde Ȝ. La loi de Beer-Lambert donne une relation entre l'absorbance AȜ et la concentration c de l'espèce chimique en solution:

Avec :

utilise des cuves de 1 cm. c la concentration de l'espèce considérée en solution (exprimée en mol.L-1). İ le coefficient d'absorption molaire (exprimé usuellement en L. mol-1. cm-1). C'est une grandeur qui dépend de l'espèce chimique considérée, de la longueur d'onde d'analyse, du solvant et de la température.

Limitations de la loi de Beer-Lambert

La loi de Beer-Lambert, qui ne concerne que la fraction de la lumière absorbée, est vérifiée dans les conditions suivantes : La lumière utilisée doit être monochromatique ;

Les concentrations doivent être faibles ;

La solution ne doit être ni fluorescente ni hétérogène ; le soluté ne doit pas donner lieu à des transformations photochimiques ; le soluté ne doit pas donner des associations variables avec le solvant.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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1.3. MESURES D'ABSORPTION :

a) Principe de l'appareil : L'absorbance (ou la transmittance) peut être mesurée par un spectrophotomètre dont le schéma de principe est représenté sur la figure suivante. S : Source de lumière blanche (polychromatique). F1 : Fente (diaphragme) permettent de sélectionner l'intensité de la lumière blanche.

P : Dispositif dispersif (prisme).

F2 : Fente sélectionnant une longueur d'onde souhaitée.

C : Photodétecteur (cellule photoélectrique) engendrant un courant d'intensité proportionnelle

à l'intensité de la lumière reçue. L'intensité de ce courant est traduite en absorbance sur le

galvanomètre G (afficheur). b) Mesure de l'absorbance : Pour mesurer l'absorbance, il fallait effectuer ces étapes suivantes :

Choisir une longueur d'onde "Ȝmax ».

Les mesures sont faites de préférence à une longueur d'onde correspondant à un maximum courbe est appelé spectre d'absorption.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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Placer dans le porte-cuve une cuve contenant une solution du blanc* de même composition que la solution dont on veut mesurer l'absorbance, à l'exception de la substance étudiée. "Afficher " une absorbance nulle. Remplacer la solution du blanc par la solution étudiée* et lire l'absorbance. L'utilisation de la cuve du blanc permet de mesurer uniquement l'absorbance du produit

étudié en éliminant l'absorption du solvant et de la cuve, les phénomènes de diffusion et

les réflexions aux interfaces. * cuve remplie aux 2/3 seulement, extérieur bien essuyé. Si l'absorbance de la solution étudiée est supérieure à 2, il convient de la diluer en conséquence. c) Utilisation des mesures : rapport des absorbances de deux solutions contenant la même substance est égal au rapport des concentrations : A1 / A2 = c1 / c2. Il suffit donc de mesurer les absorbances d'une solution "étalon" (concentration connue) et de la solution étudiée pour déterminer la concentration dans cette dernière. Pour diminuer l'incertitude sur la détermination de la concentration, il est préférable de tracer une courbe d'étalonnage en utilisant des concentrations variables et connues de la substance à doser. Les mesures faites à plusieurs dilutions avec la solution à doser sont alors comparées à la courbe d'étalonnage.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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2. Les colorants alimentaires

Les colorants alimentaires sont des additifs utilisés pour normaliser ou restaurer la couleur des aliments. L'un des colorants de synthèse les plus utilisés dans l'industrie agroalimentaire et surtout dans la production des jus de fruits et des boissons gazeuses à l'orange est le " jaune orangé S/ jaune soleil FCF (SIN110) ». Ce colorant chimique est une poudre ou granules rouge orangé très soluble dans l'eau. Sa formule brute est : C

16H10N2Na2O7S2 et sa masse molaire est de 452,37 g/mole.

N.B. La norme maximum tolérée du SIN 110 est de 50 mg/L. Ce colorant est utilisé également dans certaines sirops, soupes instantanées, fromages, gâteaux, pâtisseries, pâtes de fruits, glaces, bonbons...en cosmétologie sous l'appellation

"CI 15985" et dans certains produits pharmaceutiques (par exemple : agent colorant pour les comprimés de vitamine C).

La consommation de SIN110 peut provoquer : Un syndrome d'hyperactivité chez les enfants s'il est associé à des benzoates (= les additifs de SIN210 à SIN215).

De l'urticaire et de l'eczéma notamment si il est associé avec de l'aspirine (intolérance aux salicylates), des diarrhées et des troubles gastriques.

Le cancer, le SIN110 est possiblement cancérigène et classé catégorie 3 au CIRC (Centre International de Recherches sur le Cancer). Il a été montré qu'il accroit le

nombre de tumeurs chez les animaux.

le SIN110 est interdit dans certains pays comme la Norvège et la Finlande. SIN : Système International de Numérotation des additifs alimentaires.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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3. Objectif

Le but de cette manipulation est la détermination de la longueur d'onde d'absorption maximale "Ȝmax » et de la teneur en "SIN110 jaune orangé S » d'une boisson gazeuse.

4. Produits et matériel

4.1. Produits utilisés

Poudre du colorant alimentaire SIN110 ; 1g

Eau distillée ; 3 L

4.2. Matériel : Spectrophotomètre.

2 cuves.

Papiers joseph.

Balance analytique.

Verre de montre.

Spatule. 8 tubes à essais.

Agitateur des tubes.

2 Fiole jaugée de 100 mL.

Entonnoir.

Pipettes 10 et 2 mL

Pro-pipettes. 5. Mode opératoire

5.1 - Détermination de la longueur d'onde d'absorption maximale "Ȝmax » :

Dans une cuve, mettre le solvant (eau distillée) sur lequel on fera le "zéro optique". Dans une autre cuve, mettre une solution du colorant alimentaire SIN110 à 4,42 x 10-4 M.

A partir de Ȝ = 450 nm, faire une mesure tous les 5 nm ou moins quand l'absorbance varie rapidement, dans le sens croissant des longueurs d'onde, jusqu'à 550 nm. Pour chaque longueur d'onde, ne pas oublier de "refaire le zéro optique" avec une cuve remplie d'eau distillée.

TP n° 1 : Dosage d'un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie

directe.

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5.2 - Préparation de la gamme des étalons

Préparer la gamme d'étalonnage en suivant le tableau 01 : Tableau 01 : Préparation de la gamme d'étalonnage.

Tubes Témoin 1 2 3 4 5 6 7 SIN110 à 4,42 x 10-4 M (ml) 0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,2 1,5 2,0 H2O q.s.p 10 ml 10 9,7 9,5 9,2 9,0 8,8 8,5 8,0

Lire l'absorbance à la longueur d'onde d'absorption maximale " Ȝ max ».

6.2- Pour quelle longueur d'onde Ȝ l'absorbance est-elle maximale ? La noter sur le

graphe. 6.3- Quelle est la couleur de la solution du colorant alimentaire "SIN110»? La longueur d'onde Ȝmax correspond-elle à la couleur complémentaire de cette solution?

6.4- Déterminer les concentrations massiques et les dilutions des étalons.

6.7- Déterminer la concentration massique du "SIN110 jaune orangé S» dans la boisson

gazeuse. Est-ce que le fabricant de la boisson gazeuse a respecté la norme internationale ?

6.8- Calculer le coefficient d'absorption molaire.

TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de

Trinder.

(Spectrophotométrie indirecte) TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder. (Spectrophotométrie indirecte)

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1. Rappel : Méthodes de dosage spectrophotométrique

Spectrophotométrie directe et indirecte

Deux cas sont possibles selon la substance à doser : (1)- la substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (substance colorée) ou dans l'UV ; on fait alors un dosage spectrophotométrique direct de cette substance. (2)- la substance à doser ne possède pas un pic d'absorption caractéristique dans le visible (substance incolore) ou dans l'UV ; on fait alors un dosage spectrophotométrique indirect de cette substance en dosant un produit coloré résultant d'une réaction de coloration spécifique à la substance à doser. Substance incolore + réactifs de coloration Produit coloré Comment calculer la concentration c d'un échantillon :

Méthode directe :

Elle consiste à mesurer l'absorbance Aéch et à calculer directement la concentration c

éch en appliquant la loi de Beer-Lambert.

Elle nécessite de connaitre le coefficient d'absorption molaire İ de la substance à doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car İ varie avec TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder. (Spectrophotométrie indirecte)

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Méthodes indirectes : Elles ne nécessitent pas de connaitre İ : a)- Méthode par comparaison avec un étalon unique : Elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance Aéch de la solution à doser "échantillon" et l'absorbance Aet d'une solution "étalon" ou "standard" de concentration connue cet, puis à calculer la concentration de la solution à doser céch ; en utilisant l'équation suivante : céch= (Aéch x cet) /Aet . Elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité. b)- Méthode par comparaison avec une gamme d'étalonnage : Elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère", à mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une détermination graphique de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser) ; Elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de manipulation.

2. Introduction

Le glucose est un hexose (ose à 6 C), possédant comme fonction réductrice une fonction aldéhyde (aldose). En tant qu'aldohexose, le glucose en solution se présente sous plusieurs

formes en équilibre : linéaire ou cyclisées. Les plus stables, et donc les plus abondantes dans

la nature, sont les formes cycliques pyrannes.

L'enzyme (la glucose-oxydase) étant très spécifique, le glucose peut être décelé et dosé

seul dans un mélange complexe de glucides. La méthode proposée est la plus employée pour déterminer le taux de glucose dans le sang (glycémie) ou dans les urines (glycosurie), sous TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder. (Spectrophotométrie indirecte)

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forme liquide ou sous forme de bandelettes réactives, que ce soit en laboratoire d'analyses, en milieu hospitalier ou par les diabétiques (autocontrôle de la glycémie).

3. Principe

La Glucose-oxydase (GOD) catalyse l'oxydation du glucose en acide gluconique. Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) formé de cette réaction est détecté par un accepteur d'oxygène

chromogénique, le Phénol-Aminophénazone, ce chromogène réduit incolore, en présence

de la Peroxydase (POD), sera oxydé en un dérivé coloré en rose (Quinone). L'intensité de la

coloration obtenue est proportionnelle à la quantité initiale en glucose. ȕ-D-Glucose + O2 + H2O GOD Acid gluconique + H2O2 H

2O2 + Phénol + Aminophenazone POD Quinone + H2O

On peut simplifier l'ensemble de ces réactions ainsi :

L'intérêt d'utiliser un chromogène est d'obtenir un produit coloré permettant d'effectuer des

mesures spectrophotométriques faciles à mettre en oeuvre.quotesdbs_dbs35.pdfusesText_40

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