[PDF] Les outils de diagnostic pan-génomiques : Caryotype ACPA Exome

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Les outils de diagnostic

pan-génomiques :

Caryotype

ACPA Exome

LE CARYOTYPE : ANALYSE DE LA

STRUCTURE CHROMOSOMIQUE

Le caryotype, l'analyse chromosomique par puce à ADN (ACPA) et le séquençage de l'exome sont des approches dites "pan-génomiques», u?lisées pour le diagnos? c de maladie géné?que. En effet, ces techniques ne ciblent pas une anomalie précise dans l e génôme. Chaque technique a sa limite de résolu?on. Le choix de l'analyse se fait en fonc ?on de l'indica?on clinique.

RAPPELS SUR LES

OUTILS PAN-GÉNOMIQUES

QU'EST-CE QUE LE CARYOTYPE ?

Le caryotype est l'analyse du nombre et de

la structure des chromosomes. La résolu?on du caryotype est limitée à environ 10 10 6 pb (résolu?on microscopique) et les anomalies plus pe?tes ne sont pas détectables.

INDICATIONS CLINIQUES DU CARYOTYPE

Malgré sa résolu?on rela?vement faible, le

caryotype reste indiqué pour la recherche des syndromes chromosomiques les plus fréquents co?e, par exemple, la trisomie 21.

Le caryotype est également la meilleure tech

nique pour me?re en évidence des mosaïques cellulaires. Il est donc pa?iculièrement adapté

CARYOTYPE

Étude globale de génome

Résolu?on : 5-10 10

6 pbACPAÉtude globale de génomeRésolu?on : 10 à 1000 10 3 pbEXOME

Étude de 20 000 gènes

Résolu?on : 1pb

FIGURE 1. COMPARAISON DE LA RÉSOLUTION DU CARYTOTYPE, DE L'ACPA ET DU SÉQUENÇAGE DE L'EXOME.

GENES GENES

GENESEXON

INTRON

EXON

CHROMOSOME 7

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LE CARYOTYPE : EN PRATIQUE

FIGURE 2 : INDICATIONS CLINIQUES DU CARYOTYPE POSTNATAL

EN PRATIQUE :

• Prélèvement : 2x5 ml de sang total hépariné • Conserv ation et transport : température ambiante • Technique : Cytogénétique conventionnelle • Délai de rendu des résultats : 21 jours • Attestation d'information et de consultation médicale • Feuille de demande d'analyse et consentement éclairé de chaque personne pour la recherche de syndromes associés le plus souvent à une mosaïque comme le syndrome de Turner.

Le caryotype est actuellement le seul

examen permettant d'analyser la structure chromosomique. Par conséquent, c'est l'analyse de choix pour la recherche de remaniements dits équilibrés (absence de perte ou de gain de matériel chromosomique) tels que les translocations entre deux chromosomes, les inversions intrachromosomiques, les insertions de chromosomes.

Un remaniement chromosomique équilibré

n'entraîne pas de maladie pour le porteur du remaniement mais peut avoir des conséquences sur sa reproduction. Pour cette raison, le caryotype est prescrit pour les patients présentant un trouble de la reproduction (infertilité, fausses couches à répétition).

Le caryotype est indispensable pour définir le

mécanisme d'une anomalie chromosomique mise en évidence par un autre test. Il permet ainsi de rendre un conseil génétique adapté, afin d'évaluer en particulier le risque de récidive d'une anomalie dans une famille.

• Suspicion de syndrome de klinefelter

• Azoospermie, oligo-asthénospermie

• Gynécomastie

• Suspicion de syndrome de Turner

• Petite taille ou retard staturo-pondéral

• Retard pubertaire

• Aménorrhée primaire

• Aménorrhées secondaire

• Insuffisance ovarienne

• Ménopause précoce

• Bilan pré-ICSI, pré-FIV, don de gamètes

• Stérilité non étiquetée

• Bilan de fausses couches spontanées

• Suspicion de trisomie 21

Malformations génitales ou ambiguïtés sexuelles

• T

ranssexuel

INDICATIONS

CARYOTYPE

ANORMAL

CONSEIL GÉNÉTIQUE

TESTS COMPLÉMENTAIRES (FISH)

ENQUÊTE FAMILLIALE

STRATÉGIE DIAGNOSTIC POSTNATAL PAR CARYOTYPE

NORMAL

L'ANALYSE CHROMOSOMIQUE PAR PUCE

À ADN (ACPA) : RECHERCHE D'UN

DÉSÉQUILIBRE CHROMOSOMIQUE

L'ACPA : EN PRATIQUE

QU'EST-CE QUE L'ACPA ?

L'analyse chromosomique par puce à ADN

(ACPA ou "puce à ADN") est une analyse permettant la recherche d'un déséquilibre chromosomique (perte ou gain de matériel génomique) à très grande résolution. Il s'agit d'une méthode quantitative. Un remaniement équilibré ou une mosaïque faible ne peuvent donc pas être détectés par cette méthode. Le mécanisme du déséquilibre éventuellement trouvé doit être étudié par des techniques complémentaires.

INDICATIONS CLINIQUES DE L'ACPA :

En cas de maladie avec une forte probabilité de déséquilibre génomique, l'ACPA est l'examen de choix : sa résolution est 100X supérieure à celle du caryotype (environ 10Kb-1Mb). Un déséquilibre mis en évidence par ACPA est appelé

CNV (CNV = Copie Number Variant).L'ACPA est

indiquée en cas de déficience intellectuelle, trouble du spectre autistique et syndromes malformatifs. Lorsqu'un déséquilibre est trouvé par ACPA, il est souvent nécessaire de réaliser un caryotype pour déterminer l'implication de la structure chromosomique en vue du conseil génétique. Environ 15% des patients présentent un déséquilibre chromosomique pathogène détectable par ACPA.

L'ACPA peut aussi détecter des CNV dits de

prédisposition à des pathologies sans lien avec le phénotype observé (autisme, maladies de révélation tardive,...) qui doivent être interprétés avec précaution.

EN PRATIQUE :

• Prélèvement : 10 ml de sang total EDTA du patient • Conservation et transport : température ambiante • Technique : DNA microarray, SNP array • Délai de rendu des résultats : 4 semaines en l'absence d'

éventuels tests complémentaires

• Attestation d'information et de consultation médicale • Feuille de demande d'analyse et consentement éclairé de chaque personne Déficience intelectuelle - Hypotonie - Spectre autistique - Trouble du comportement - Troubles envahissants du développement - Retard d'acquisition du langage ou du développement - Epilepsie syndromique - Dysmorphie faciale - Syndrome malformatif FIGURE 3. INDICATIONS POUR LE DIAGNOSTIC POSTNATAL PAR PUCE À ADN

INDICATIONS POUR UNE STRATÉGIE

DIAGNOSTIC POSTNATAL PAR PUCE (ACPA)

LE SÉQUENÇAGE D'EXOME COMPLET (WES) :

RECHERCHE D'UNE ANOMALIE DANS LA

SÉQUENCE D'UN GÈNE

LE SÉQUENÇAGE COMPLET DE L'EXOME

DOIT ÊTRE PROPOSÉ POUR :

• Les patients dont toutes les analyses de génétique disponibles jusqu'à présent sont négatives. • Les patients avec une maladie très hétérogène dans laquelle la modification génétique causale pourrait être localisée dans de nombreux gènes (telle que la déficience intellectuelle). • Les patients nécessitant un diagnostic différentiel de plusieurs maladies génétiques. • Les patients dont le tableau clinique n'est pas spécifique.

QU'EST-CE QUE LE SÉQUENÇAGE

D'EXOME COMPLET ?

Chaque cellule du corps humain contient

l'ensemble de l'information génétique propre à chaque individu, le génome. Une fraction de ce génome contient des unités d'information, les gènes (environ 20000 chez l'homme). Les régions géniques codant pour la production de protéines sont appelées les exons et représentent 1 à 2% du génome humain. Leur analyse par séquençage est appelée séquençage d'exome complet, aussi nommée "whole exome sequencing" (WES).

Le séquençage de l'exome complet est devenu

possible grâce aux performances du séquençage massif en parallèle (MPS). Il permet une analyse non ciblée, à très haute résolution, des modifications qualitatives des gènes. L'analyse est réalisée en comparant la séquence de l'exome du patient à des séquences de référence obtenues par séquençage d'un groupe d'individus sains. Les variations de séquences observées chez le patient et pouvant être en relation avec sa maladie, sont alors analysées individuellement et dans le contexte d'une enquête familiale afin d'en définir le mode de transmission.

INDICATIONS CLINIQUES :

Le séquençage de l'exome ne peut pas détecter un remaniement chromosomique, ni un CNV pathologique. Le séquençage d'exome peut être prescrit pour les mêmes indications que l'ACPA, ainsi que pour la recherche étiologique de maladies hétérogènes telle qu'une surdité, un problème musculaire ou une épilepsie qui nécessite le séquençage de plusieurs dizaines de gènes.

FIGURE 4. INTRONS ET EXONS

Génome

Exome

Intron

ExonExonExonIntron

On estime aujourd'hui que le séquençage

d'exome complet permet de détecter une mutation expliquant leur maladie chez environ

30 % des patients.

Comme l'ensemble des gènes du patient

est analysé, il est possible de trouver des mutations pathogènes sans rapport avec la maladie du patient, mais qui le prédisposent

à une autre maladie: cancer, cardiopathie,

etc... Ces résultats sont appelés " résultats secondaires ». Un résultat secondaire est rapporté au patient seulement, s'il existe un moyen thérapeutique ou autre prise en charge selon les recommandations de l'ACMG (American College of Medical Genetics). FIGURE 5. STRATÉGIE DE DIAGNOSTIC POSTNATAL PAR ACPA OU WES

STRATÉGIE DIAGNOSTIC POSTNATAL PAR ACPA OU WES

Déficience intelectuelle

• Hypotonie

Spectre autistique

Trouble du comportement

Troubles envahissants

du développement

Retard d'acquisition du

langage ou du développement

Epilepsie syndromique

Dysmorphie faciale

Syndrome malformatif

INDICATIONS

ACPA (PUCE)

ANORMAL

ANORMAL

CARYOTYPE / FISH

TESTS COMPLÉMENTAIRES ET CONSEIL GÉNÉTIQUE

EXOME COMPLET (WES)

PHÉNOTYPES NON SPÉCIFIQUES

MALADIE GÉNÉTIQUEMENT

HÉTÉROGÈNE

PATIENT EN ÉCHEC DIAGNOSTIQUE

(ERRANCE MÉDICALE)

NORMAL

LE SÉQUENÇAGE D'EXOME COMPLET

EN PRATIQUE

QUELS SONT LES ÉCHANTILLONS

NÉCESSAIRES ?

Idéalement, le séquençage de l'exome nécessite de disposer de l'échantillon du patient (cas index) mais aussi de ses parents biologiques.

Ainsi, tous les variants identifiés comme

pathogènes ou probablement pathogènes feront l'objet d'une vérification par un séquençage ciblé indépendant à la fois chez le cas index mais également chez ses parents afin d'en préciser le mode de transmission. À l'émission du résultat, les informations pertinentes et utiles au conseil génétique de la famille seront alors délivrées.

EN PRATIQUE :

• Prélèvement : 4x5 ml de sang total EDTA pour le cas index, 1x5 ml de sang EDTA pour chacun de ses parents • Conservation et transport : température ambiante sous 7 jours

Technique : NGS

• Délai de rendu des résultats : 8-12 semaines • Attestation d'information et de consultation médicale • Feuille de demande d'analyse et consentement

éclairé de chaque personne

FIGURE 6. TABLEAU RÉCAPITULATIF DES ANOMALIES DÉTECTÉES PAR CARYOTYPE, ACPA, EXOME

CaryotypeACPAExome

Remaniement

chromosomique

équilibré

Déséquilibre

chromosomique

Déséquilibre

chromosomique fin

Anomalie de la

séquence d'un gène

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