[PDF] Le gène du PSA : intérêt pour la détection des cellules circulantes

View - Download Le gène du PSA : intérêt pour la détection des cellules circulantes

Previous PDF

Next PDF

Progrès en Urologie (1997), 7, 930-936

930
Le gène du PSA : intérêt pour la détection des cellules circulantes dans le cancer de la prostate Alexandre de la TAILLE(1, 4), Marc COLOMBEL (1), Serge AMSELLEM (2), Béatrice MUSCATELLI (1), François RADVANYI (3), Etienne MAZEMAN(4), Claude Clément ABBOU (1), Dominique CHOPIN (1) (1) Service d'Urologie, 2)Service de Biochimie, Groupe d'Etude des Tumeurs Urologiques,

Hôpital Henri Mondor, Créteil, France

(3) UMR 144, Institut Curie, Paris, France, (4) Service d'Urologie, CHRU, Lille, France

RESUME

La détection des cellules circulantes dans les can- cers connait un regain d'attention grâce à la simpli- cité, la spécificité et la sensibilité d'une technique de biologie moléculaire : la RT-PCR.Cette détection repose sur la notion de spécificité d'une séquence d'ARN exprimée par la cellule cancéreuse. Pour le cancer de prostate, le PSA apparaît comme le marqueur idéal des cellules prostatiques circu- lantes par sa spécificité.Il semble donc essentiel de connaître ce gène ainsi que ses caractères molécu- laires.Nous proposons une revue didactique des gènes de la famille des kallicréines dans le but d'ex- poser les avantages et les difficultés de l'utilisation de l'ARN messager du PSA comme marqueur des cellules prostatiques circulantes. Mots clés : Kallicréine, PSA, prostate, cancer, RT-PCR.

Progrès en Urologie (1997), 7, 930-936.

Depuis quelques années, la notion de cellules circulantes dans les cancers connaît un regain d'attention grâce à la PCR (Polymerase Chain Reaction).Technique inventée par MU L L I Sen 1985 [31], découverte pour laquelle il reçut le prix Nobel de Chimie en 1993, la PCR permet l'amplification, à des milliards de copies, d'un segment connu d'Acide DésoxyriboNucléique (ADN). L'application en routine est devenue possible par l'utili- sation de cycles thermiques alternant des températures de synthèse d'ADN et de séparation des hélices (Figure 1), par l'apparition d'une ADN Polymérase Thermostable [40] et la possibilité de transcrire les Acides

RiboNucléiques (ARN) en ADN complémentaire

( Transcription reverse ou RT ) . La détection de cellules circulantes repose sur la trans- cription d'un gène spécifique de la cellule prostatique. Le succès de cette technique de biologie moléculaire est triple : simple d'utilisation, sensible et spécifique. Seule l'hématologie a actuellement une application en routine de cette technique par la recherche de maladie résiduelle après traitement de la leucémie lymphoblas- tique aiguë par amplification génétique d'un fragment d'ADN spécifique, siège de translocation 14/18 [27]. Entre le domaine de la recherche et la clinique, plu- sieurs autres spécialités médicales s'intéressent à la RT- PCR et à la détection de cellules soit dans le sang péri- phérique soit dans la moëlle par exemple en dermatolo- gie pour les mélanomes [44], en neurologie pour les neuroblastomes [32] ou en gynécologie où la présence de cellules dans la moelle détectée par RT-PCR est un indice de mauvais pronostic du cancer du sein [8]. En urologie, une des premières applications a été la possibilité de détecter des cellules tumorales prosta- tiques dans les adénopathies métastatiques par RT-PCR de l'ARN messager du PSA (Antigène Spécifique de Prostate), méthode de plus grande sensibilité que l'exa- men anatomopathologique [29].En 1994, KATZa intro- duit la possibilité de stadification du cancer par RT- PCR : la présence de cellules circulantes serait corrélée au stade extracapsulaire du cancer [17].Dans les stades avancés, il semble que la fréquence des patients posi- tifs soit supérieure à 80% [17, 34]. Du fait du développement de ces techniques avec comme principal objectif d'améliorer la stadification des cancers de prostate, il est essentiel de comprendre la structure du gène du PSA qui est actuellement le plus utilisé pour reconnaître spécifiquement les cellules cir- culantes prostatiques.

SYNTHESE

Le PSA est une protéine du groupe des kallicréines. Ces protéines sont isolées initialement par FREYet al. en 1930, qui isole une substance à partir d'urines humaines ayant la propriété d'être hypotensive [13]. Elle est aussi détectée dans le pancréas [18], d'où le nom de kallicréine venant du grec "kallikréas» qui signifie pancréas (actuellement appelé hK1).Cette pro- téine fut dans les années suivantes retrouvée au niveau Manuscrit reçu : janvier 1997, accepté : juin 1997. Adresse pour correspondance : Dr.M.Colombel, Service d'Urologie, Hôpital

Henri Mondor, 51, avenue du Général de Lattre de Tassigny, 94010 Créteil Cedex.0930 DE LA TAILLE 4/08/01 14:30 Page 1

931
du sang, des glandes salivaires, de l'intestin, du pou- mon et du cerveau. Les kallicréines sont des protéines ayant un poids moléculaire entre 27 et 40 KiloDalton (kD) et un point isoélectrique de pH 4 [6].Comme l'élastase, le throm- bine, la plasmine, le kininogène, la chymotrypsine et la trypsine, elles composent la famille des serines pro- téases clivant le kininogène et produites par les glandes salivaires, le rein, la prostate et le pancréas [24]. Il existe 3 kallicréines humaines dont la nomenclature a été établie par la conférence de consensus (Figure 2) de Munich en 1991 [2].Les 3 protéines sont appelées hK 1, première kallicréine identifiée, hK 2 et hK 3 qui est plus connue sous le nom de PSA.Les gènes corres- pondants désignés par hKLK (hsignifiant human) suivi du numéro 1, 2 ou 3, ont la même structure génique : 4 introns et 5 exons.Le locus des kallicréines est sur le chromosome 19q13.2-13.4 [12, 37, 46]. hK 3 ou PSA Le PSA a été mis en évidence initialement dans le sper- me sous le nom de gamma séminoprotéine (E1 ou p30) [3] et utilisé comme marqueur du liquide séminal dans les enquêtes criminelles sur le viol [43], puis dans le tissu prostatique [47, 48]. Cette protéine est présente en grande quantité dans le sperme et en très faible quanti- té dans le sang.Aujourd'hui, le PSA sérique est consi- déré comme le meilleur marqueur de la pathologie tumorale prostatique [33, 45]. Protéine PSA: Le PSA est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de 33 kD, ayant une activité protéo- lytique chymotrypsine like.Son poids moléculaire de

28.5 kD est déterminé par spectrométrie de masse [21,

49].Elle est synthétisée sous forme d'une prépropro-

téine de 261 acides aminés.La protéine mature est constituée de 237 acides aminés.Une séquence pepti- dique de signal de 17 acides aminés, hydrophobe, lui permet d'entrer dans le réticulum endoblastique (voie de sécrétion). Un profragment de 7 acides aminés a pour fonction de garder la protéine inactive. La propro- téine est ensuite transportée dans une vésicule vers la membrane plasmatique et sécrétée. Le lieu et les condi- tions de passage de la proprotéine en protéine ne sont pas encore connus [24]. Rôle du PSA: Son rôle est la liquéfaction du sperme à l'éjaculation par clivage des séminogélines I et II et des fibronectines sécrétées par les vésicules séminales [22,

23]. Il a été montré récemment que le PSA pouvait cli-

ver la protéine porteuse de l'IGF (Insulin Growth Factor). La protéolyse de l'IGF-BP3 par le PSA entraî- nerait une baisse de l'action de l'IGF d'où l'idée que le PSA pourrait moduler localement l'action de l'IGF sur le système de reproduction et sur le cancer de la pros- tate [7]. D'autre part, l'addition de PSA purifié dans les cultures de cellules épithéliales prostatiques augmente- rait leur prolifération [7] mais le mécanisme d'action est encore à l'étude. Gène du PSA: l'ADN complémentaire a été déduit de la séquence protéique en 1987 par LUNDWALL[25] et par RIEGMANen 1988 [36]. Par hybridation à une sonde spécifique de PSA, 7 transcrits du PSA diffé-

rents ont été identifiés chez les lignées cellulaires can-céreuses de prostate PC 82 et PC EW (respectivement

isolées à partir d'une tumeur primitive et d'une adéno- pathie métastatique) de 0.5 à 5.6 kb. Le plus important, PA 75 est de 1.5 kb et l'ADN complémentaire corres-

pondant à une préproprotéine de 261 acides ami-nés[25, 36] et contient l'information complète d'une

protéine de 35 kD. Deux autres transcrits moins impor- tants sont le résultat d'un épissage alternatif. Un trans-

crit de 0.9 kD, PA 424, est formé par une rétentionintronique et une polyadénylation alternative (Figure

3).Le second de 1.9 kD, PA 525, résulte d'un épissa-

ge alternatif lié à un site cryptique donneur [36]. Ces 3 transcrits diffèrent dans la terminaison 3'.Il est donc possible pour RIEGMAN[36] que ces transcrits synthé- tisent 3 formes de protéines différentes.GALLEE[15] a

extrait la protéine PSA d'un adénome prostatique ettrouve, après purification, une protéine de 35 kD et

une ou deux protéines de 20-25 kD qui pourraient résulter pour RIEGMAN[36] soit des autres transcrits soit d'une dégradation de la protéine PSA de 35 kD. La fonction de PA 424 et PA 525 n'est pas connue et seule une purification des protéines correspondantes et leur caractérisation pourraient montrer leur activité enzymatique. En utilisant des fragments d'ADN complémentaire comme sonde d'hybridation, RIEGMANisole le clone de cette protéine sur le génome humain [36]. Le gène complet (environ 6 kb) est constitué de 4 introns et 5 exons (Figure 4). Deux sites de transcription sont trou- vés 42 et 35 pb en amont du premier ATG. L'exon 1 code pour la majeure partie du peptide signal; l'exon 2 code pour les 2 derniers acides aminés du peptide séquence, les 7 acides aminés du profragment et la par- tie aminoterminale de la protéine mature; les exons 3 et

4 codent pour la protéine mature et l'exon 5 pour la

partie carboxyl terminal (51 acides aminés) et la partie

3' non codante. Le locus de hKLK 3 est sur le chromo-

some 19 entre hKLK 1 et h KLK 2 [12]. Régulation de la sécrétion de PSA: La sécrétion de la protéine PSA n'est pas constante : les lignées cellu- laires androgéno-dépendantes (PC 82 ET PC EW) et androgéno-sensibles (LnCap) l'expriment alors que PC

133, PC 135 et PC 3 ne sécrètent pas de PSA [36)].

EP S T E I N[10], par méthode immunohistochimique, montre que l'expression du PSA diminue dans les tumeurs indifférenciées.Cette hypothèse est confirmée en 1990 par GALLEEqui étudie l'expression du PSA0930 DE LA TAILLE 4/08/01 14:30 Page 2 dans les tumeurs de prostate et en particulier dans les tumeurs indifférenciées [14]. Le niveau du PSA peut être modulé in vitro sur les lignées LnCap en moins de 6 heures par apport d'an- drogènes [36, 38]. Les androgènes ont un rôle primor- dial dans le développement et le maintien de la mor- phologie prostatique. L'absence d'androgènes entraîne une absence de développement de la prostate. La régu- lation des androgènes se fait au niveau de la transcrip- tion de l'ARN du PSA, de la synthèse protéique et/ou de sa stabilité [38]. Le récepteur aux androgènes fait partie d'une superfamille de récepteurs [11] comme les récepteurs aux stéroïdes, aux hormones thyroïdiennes et à l'acide rétinoïque. Ils se fixent directement et spé- cifiquement sur l'ADN et régule la transcription du gène [38]. Ces récepteurs ont une structure fonction- nelle similaire. En général les éléments de régulation des gènes sont situés à -200 bp en amont du site de transcription.Dans cette région, le gène du PSA a plusieurs éléments de régulation bien connus. Une TATA box est située à -28 et -23 pb, une GC box en -53 et -48, une CACC box entre -129 et -125.Puis en -170, se trouve une région spécifique, AGAACAgcaAGTGCT, séquence inverse de récepteurs hormonaux [38]. Spécificité du PSA: L'expression du PSA ne semble pas spécifique des cellules épithéliales de prostate.Par études immunologiques, le PSA est présent dans les glandes périuréthrales, dans 30% des tumeurs du sein, dans les tumeurs du poumon, du côlon, de l'ovaire, du foie, du rein, des parotides, des glandes salivaires [53], dans le liquide amniotique [51] et dans le lait maternel [52]. Par RT-PCR, le tissu mammaire normal [28] et le tissu endométrial expriment des ARNmessagers du PSA [5].YUpense que le PSA est synthétisé par tous les tissus possédant des récepteurs aux stéroïdes. Cependant leur taux d'expression est très faible et il est nécessaire d'utiliser des méthodes hyper-sensibles pour le détecter.

Les 2 autres kallicréines

hK 1: connue sous différents noms comme kallicréine tissulaire, kallicréine urinaire, kallicréine réno-pancréa- tique, la protéine hK 1 mature composée de 238 acides aminés (et dont la séquence suggère une activité trypsi- ne like) est exprimée par les cellules Bêta et les cellules des acini du pancréas, le rein et les glandes salivaires sous-maxillaires [24] et plus récemment par les cellules du myomètre et de l'endométrium [5].Présente en quantité importante dans le sérum elle présente 62% d'homologie avec la protéine hK 3 (ou PSA) d'où la possibilité de réactions croisées avec des anticorps polyclonaux contre le PSA [35]. Elle a un rôle important dans la régulation de la pres- sion artérielle, la circulation capillaire et la balance sodique dans le système kallicréine-rénine [26].En effet, hK 1 clive le kininogène en kallidine qui devient après action d'une aminopeptidase la bradykinine (induisant vasodilatation, augmentation du flux capil- laire et causant une contraction des muscles lisses intestinaux et bronchiques).Il n'est donc pas étonnant connaissant cette action, de retrouver hK 1 au niveau des urines, de la salive, du liquide amniotique, du pla- centa, du myomètre, du liquide synovial, des sécrétions nasales des allergiques et des lavages bronchiques des asthmatiques [4]. BAKERen 1985 [1] séquence l'ADN complémentaire, séquence génomique de 4.5 kb [12] et son gène hKLK

1 est situé sur le chromosome 19 avec les 2 autres

gènes des kallicréines. hK 2 : La protéine hK 2 ou anciennement hGK 1 (pour Human Glandular Kallikrein) est synthétisée par les cellules épithéliales de prostate [30].Par RT-PCR, hK

2 a été détecté dans les cellules endométriales [5] mais

elle est absente dans le rein, le pancréas, le foie, le muscle strié, le poumon, la rate, le thymus foetal, le cerveau et la moelle épinière [30]. SCHELDICHen 1987 [41] isole et séquence le cDNA de hK 2.Par hybridation "northern blot» avec des sondes spécifiques de hK 2, hK2 a 2 transcrits principaux de

1.2 et 1.5 kb [25].HENTTU[16] trouve une multitude de

transcrits différents entre 1.6 et 4.5 kb dans l'hypertro- phie bénigne et le cancer prostatique.Le plus important

est le 1.5 kb codant pour une préproprotéine de 261acides aminés présentant 78% d'homologie avec hK 3

et 66% avec hK 1 [6, 16] (Figure 5).Sa séquence sug- gère une activité trypsine like [41].Cette protéine n'a pas encore été purifiée [4].Le gène hKLK 2 se situe sur le chromosome 19. Une étude faite sur les cellules LnCap, cellules cancé- reuses de prostate androgénosensibles, prélevées sur une adénopathie métastatique, montre que l'expression de hK 2 peut être stimulée par les androgènes [39].Par contre les tumeurs androgénoindépendantes comme

PC 133 ou PC 135 n'expriment pas hK 2.Le rapport

hK2/PSA n'est pas constant dans les lignées cellulairesétudiées [39] mais peut être évalué entre 10 et 30%

[16]. Sa fonction reste encore inconnue.Etant exprimé par les cellules épithéliales prostatiques, certains auteurs envisagent de l'étudier comme marqueur de l'adéno- carcinome de prostate [5]. Les différentes techniques d'amplification génique Les cellules circulantes dans le sang sont en quantité très faible, diluées parmi des milliards de cellules san- guines (globules rouges, plaquettes, monocytes, lym- phocytes, polynucléaires...).quotesdbs_dbs28.pdfusesText_34

[PDF] Nom Régime Téléphone Code Régime Caisse Gestion Centre

[PDF] Transferts internationaux : SWIFT, IBAN ou les deux ? Nous avons

[PDF] codes insee des pays ou nationalites - FOAD

[PDF] codes insee des pays ou nationalites - FOAD

[PDF] codes INSEE des communes

[PDF] Code de l 'IRPP et l 'IS 1 1 LIVRE 2:CODE DE L 'IRPP ET - IMAC Audit

[PDF] Liste des étudiants admis ? s 'inscrire aux ENCGs au titre de l - tafem

[PDF] massar moutamadris pour élèves: mode d 'utilisation - site de formation

[PDF] decoder les metar - IVAO France

[PDF] Code minier (nouveau) - Codes Droitorg

[PDF] quot Code Mixing quot In - Wiley Online Library

[PDF] Munsell Soil Color Chart

[PDF] codes naf - AEFccifr

[PDF] E-CESU : payez vos frais de crèche AP-HP - Chèque Domicile

[PDF] Guide Utilisateur