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Biologie - TP B13-14. Correction

TP B13-14. Enzymologie - Correction

I.Etude de la vitesse d'une enzyme en fonction du temps 1.Loi de Beer-Lambert et la mesure de l'absorbance

2.Manipulations

a)Solution de référence b)Solution étalon c)Mesures de la vitesse de la réaction en fonction du temps

3.Exploitation des résultats

a)Détermination du lien absorbance - concentration •Calculez la concentration d'amidon dans la solution étalon.

On fait un bilan de matière :c1v1=c2v2=cm2v2

M⇒c1=cm2v2

Mv1

Où :

-c1 et v1 sont la concentration molaire et le volume de la solution finale, respectivement -c2 et v2 sont la concentration molaire et le volume de la solution initiale, respectivement -cm2 est la concentration massique de la solution initiale

-M est la " concentration molaire d'amidon » c'est-à-dire le nombre de moles de glucose polymérisé sous

forme d'amidon par litre.

A.N. : c1 = 5,14.10-4 mol.L-1.

•Déduisez-en la valeur de ελL LL.

A = ελ c1 L → ελ L = A/c1. On connait c1 (question précédente), et on lit la valeur de A sur le spectrophotomètre.

L'absorbance réelle varie selon les groupes (à cause des incertitudes de mesure et de manipulation). La valeur retenue

ici pour les calculs est A = 0,54 pour la solution étalon.

On en déduit ελ L = 1050 L.mol-1.

b)Détermination de la vitesse en fonction du temps •Justifiez que v=-1

2ελLdA

dt, avec v la vitesse de la réaction, ελ l'absoptivité et L la longueur de la cuve.

La vitesse est définie commev=d[maltose]

dt, doncv=-1

2d[amidon]

dt(car un maltose correspond à une ablation de 2 molécules de glucose). Or [amidon]=A

ελL, doncv=-1

2ελLdA

dt. •Tracez le graphe de la vitesse de la réaction en fonction du temps.

Les résultats ont été assez variables sur la salle, avec parfois des vitesses particulièrement importantes, de façon non

expliquée. On présente ici un exemple d'une évolution normale (attendue).

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0102030405060700,0400,0600,0800,1000,1200,140[amidon] en fonction du temps

temps (s)[amidon] (mmol.L-1)0102030405060700,0000,0010,0010,0020,0020,0030,0030,0040,004Vitesse en fonction du temps

Temps (s)

Vitesse (mmol.L-1.s-1)Pour information, on a inséré la courbe de [amidon] en fonction de t. La courbe de v en fonction de t est déterminée en

déterminant le coefficient directeur de quelques tangentes à la courbe de gauche. •Commentez votre résultat.

La vitesse diminue au cours du temps, ce que l'on interprète comme étant l'effet de la diminution de la concentration en

substrat disponible, la concentration en enzyme ne variant pas. II.Etude de la vitesse initiale d'une enzyme en fonction de la concentration en substrat

1.Manipulations

a)Préparation des solutions volume solution →12345 eau distillée2,65 mL2,70 mL2,75 mL2,80mL2,85 mL solution d'amidon (1 g.L-1)250 μL200 μL150 μL100 μL50 μL lugol 1 %20 μL20 μL20 μL20 μL20 μL solution d'enzyme100 μL100 μL100 μL100 μL100 μL total3,02 mL3,02 mL3,02 mL3,02 mL3,02 mL concentration en amidon (g.L-1)0,0830,0670,0500,0330,017 concentration en amidon (mol.L-1)5,1.10-44,1.10-43,1.10-42,0.10-41,0.10-4 b)Mesure de la vitesse initiale

2.Exploitation des résultats

•Déterminez pour chaque solution la concentration molaire initiale en amidon (valeurs à compléter dans

le tableau II.1.a) (voir plus haut)

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•Déterminez viL Lpour chacune des cinq solutions. NB : on notera que la relation entre l'absorbance et la

vitesse utilisée en I.3.b. reste valable ici.

0,050,10,150,20,250,30,350,40,450,50,5500,10,20,30,40,50,60,70,80,9vi en fonction de [S]

[S] (mmol.L-1)vi (mmol.L-1.s-1)On a déterminé vi en traçant, pour différentes concentrations initiales, la concentration en fonction de t, et en

déterminant la pente de la courbe pour t = 0 (vitesse initiale).

Il est difficile, avec ce seul graphe, de déterminer si l'enzyme est michaélienne ou non. Seule la représentation de

Lineweaver-Burk le permet.

•Tracez le graphe donnant 1 vien fonction de 1 [S]. -10-505101500,511,522,533,544,5f(x) = 0,3218 x + 0,6301

R² = 0,99681/vi en fonction de 1/C

Linear ()

1/C (mmol-1.L)

•Montrez que l'α-amylase de blé est michaélienne, et déterminez son KM et son vmax.

En représentation de Lineweaver-Burk, on peut voir que les points sont à peu près alignés. Il faudrait faire plusieurs

fois la manipulation, et surtout avec plus de 5 valeurs de vitesse, pour étayer ce résultat. On rappelle que sous cette

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hypothèse, on a : v=vmax[S]

KM+[S], donc 1

v=KM vmax1 [S]+1 vmax. L'alignement des valeurs de 1/vi valide donc le modèle

de la cinétique michaelienne. On peut déterminer vmax et KM : 1/vmax est l'ordonnée de l'intersection entre la droite et

l'axe des ordonnées, et -1/KM est l'abscisse de l'intersection entre la droite et l'axe des abscisses. On a donc :

vmax = 1/0,7 = 1,4 mmol.L-1.s-1

KM = -1/(-0,2) = 5 mmol.L-1

La validité de l'adéquation au modèle se mesure par le coefficient de corrélation linéaire R. Ici, R2 = 0,9968, ce qui est

correct. III. Etude de l'influence du pH sur la cinétique enzymatique

1.Manipulations

a)Préparation des solutions volume à prélever solution tampon21,5 mL solution de glucose2,5 mL solution d'enzyme1 mL total25 mL b)Mesures de la vitesse de la réaction en fonction du temps

2.Exploitation des résultats

•Montrez quev=-d[O2] dt.

O2 est un produit de la réaction, coefficient stoechiométrique de 1. Mêmes raisons que dans la partie I.

•Pour chaque pH, déterminez la vitesse initiale de la réaction. Construisez le graphe viL L=L Lf(pH).

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pHvitesse (mg.L-1.s-1)•Concluez

On en déduit que l'enzyme connaît son maximum d'activité pour un pH proche de 6. Ce pH correspond au pH du milieu

dans lequel cette enzyme est normalement rencontrée (en l'occurrence, le cytoplasme d'un champignon).

IV. Exercices d'enzymologie

1.La cétostéroïde-isomérase

a)En l'absence d'inhibiteur, peut-on estimer simplement la vitesse maximale ?

C'est une question plutôt qualitative. Il faudrait pour cela tracer vi en fonction de [S]. On constate alors que la courbe

se rapproche rapidement d'une asymptote pour les plus grandes valeurs de [S]. On propose grâce à ce graphe une

valeur de vmax de 0,31 mol.L-1.

Courbe suivante :

-carrés bleus : sans inhibiteur -losanges oranges : avec inhibiteur

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b)Montrez que la cétostéroïde-isomérase est une enzyme michaélienne, et déterminez vmax et Km.

Afin de déterminer si l'enzyme est michaélienne ou non, et de déterminer précisément les valeurs de vmax et Km, on passe

par la représentation en double inverse.

Courbe suivante :

-carrés bleus : sans inhibiteur -losanges oranges : avec inhibiteur

La régression linéaire est a priori tout à fait satisfaisante : l'enzyme est michaelienne. On trouve grâce à la courbe :

vmax = 1/2,5 = 0,4 mol.L-1.s-1. Cette valeur montre qu'il faut être prudent quand on détermine " à vue de nez » la vitesse

maximale : on est loin des 3,1 mol.L-1.s-1 proposés dans la question précédente. -5-3-11357911130510152025 f(x) = 1,4115 x + 2,4243

R² = 0,9993

f(x) = 0,8101 x + 2,5171

R² = 0,9989

1/[S] (mol-1.L)1/vi (mol-1.L.s)6 BCPST1 - Lycée Châtelet - Douai - Joseph NICOLAS00,20,40,60,811,21,400,050,10,150,20,250,30,35

[S] (mol.L-1) vi (mol.L-1.s-1)

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c)Déterminez vmax' et Km' dans le cas de l'inhibition. Déduisez-en si l'inhibition est compétitive ou non

compétitive.

On fait les mêmes manipulations, et on construit la représentation de Lineweaver-Burk de la cinétique avec inhibiteur.

vmax n'est pas modifié. En revanche, KM est modifié : il passe à 1,72 mol.L-1. L'inhibition est donc compétitive.

2.L'hexokinase

L'hexokinase est une enzyme catalysant la réaction glucose + ATP → glucose-6-phosphate + ADP.

a)Justifier le nom de cette enzyme.

L'hexokinase est une kinase (qui phosphoryle une molécule) spécifique des hexoses (oses à six carbones).

b)Ouvrez le logiciel RasTop, dans le dossier " logiciel prépa. » Téléchargez les fichiers 4qs7.pdb et 4qs8.pdb sur

https://www.rcsb.org/, et chargez-les dans RasTop. Ces fichiers correspondent à des structures

tridimensionnelles de l'hexokinase avec ou sans son ligand respectivement. Utilisez les fonctionnalités du

logiciel de façon à mettre en évidence un changement de forme de l'enzyme lorsqu'elle est liée à son substrat.

Interprétez ces changements.

En traitant les deux enzymes et en distinguant le substrat, on peut afficher :

On y voit une modification de la conformation de l'enzyme lors de la fixation de son substrat, qu'on appelle

l'ajustement induit.

c)Il existe plusieurs types d'hexokinases. L'hexokinase hépatique est appelée glucokinase. On rappelle que le foie

permet le stockage du glucose sous forme de glycogène. Interpréter ce rôle à l'aune du document.

L'hexokinase généraliste, présente dans tous les tissus, a un KM petit, et donc une activité forte. Une fois active, cette

enzyme est capable d'utiliser le glucose même à très petites concentrations. Cela permet à des cellules d'utiliser le

glucose, pour la glycolyse notamment, en toute circonstance.

L'hexokinase hépatique a un KM bien plus élevé, et ne peut donc catalyser la phosphorylation du glucose que pour des

concentrations en glucose beaucoup plus élevée. Cette activité de la glucokinase uniquement pour des concentrations

élevées de glucose permettrait d'expliquer que le foie soit capable d'absorber et de métaboliser le glucose dans des cas

d'hyperglycémie.

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NB : le KM de la glucokinase, c'est à dire la concentration de glucose pour laquelle l'enzyme est à la moitié de son

activité maximale, est justement proche de 0,6 mmoL.L-1, c'est à dire 1,1 g.L-1, soit une glycémie un peu élevée, à la

limite de l'hyperglycémie.

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