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1- Préparation des coupes pour observation au microscope optique Pour l’étude histologique classique la préparation des coupes fines se fait en plusieurs étapes : a) Prélèvement Le prélèvement effectué sur un organe doit se faire aussi délicatement que possible afin de ne pas meurtrir les tissus



Les colorations histologiques - Université Paris-Saclay

Les coupes du bloc de paraffine sont réalisées avec un microtome permettant d’obtenir des sections (coupes histologiques) de 3 à 5 microns d’épaisseur Les coupes sont recueillies sur des lames de verre et mises à sécher (sur la nuit à 40-45°C ou 1H max 60°C) - La plupart des tissus sont transparents



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1- Préparation des coupes pour observation au microscope optique [Figure 1] Pour l’étude histologique classique la préparation des coupes fines se fait en plusieurs étapes : a) Prélèvement Le prélèvement effectué sur un organe doit se faire aussi délicatement que possible afin de ne pas meurtrir les tissus

  • Déshydratation

    Les échantillons fixés dans des solutions aqueuses ne peuvent être imprégnés en paraffine directement. L’eau des tissus doit être éliminée par déshydratation dans une succession de bains d’éthanol de concentration croissante (70%, 95% à 100%).

  • Clarification

    Bien que le tissu soit maintenant essentiellement exempt d’eau, il ne peut toujours pas être imprégné dans la paraffine car celle-ci est non miscible dans l’éthanol. Il faut utiliser un solvant intermédiaire miscible à la fois dans l’éthanol et dans la paraffine. L’agent de clarification le plus couramment utilisé est le xylène.

Comment faire une coupe histologique ?

La préparation d’une coupe histologique consiste à réaliser des sections, c’est-à-dire des tranches très fines de tissus destinés à être observés par transparence au microscope. Les coupes à congélation présentent certains avantages que la technique en paraffine n’offre pas : la congélation permet une conservation optimale de l’ADN et de l’ARN.

Comment faire des coupes fines dans un tissu biologique ?

Le but est d’éliminer l’eau des tissus et de la remplacer par un milieu qui se solidifie pour permettre la réalisation de coupes fines (4 à 5µm). Pour cela, le tissu biologique doit être inclus dans une matrice dure (paraffine). Les principales étapes de ce processus sont la déshydratation, la clarification et l’imprégnation. Déshydratation

Comment faire des coupes de tissu?

Les coupes sont recueillies sur des lames de verre et mises à sécher (sur la nuit à 40-45°C ou 1H max 60°C). - La plupart des tissus sont transparents ?Les colorationsréalisées sur lames, accentuent les contrastes pour pouvoir reconnaîtredifférents éléments du tissu. LES ETAPES DE LA COLORATION -Déparaffinage (toluène / xylène - éthanol)

Comment traiter les tissus biologiques ?

Traitement des tissus Le but est d’éliminer l’eau des tissus et de la remplacer par un milieu qui se solidifie pour permettre la réalisation de coupes fines (4 à 5µm). Pour cela, le tissu biologique doit être inclus dans une matrice dure (paraffine). Les principales étapes de ce processus sont la déshydratation, la clarification et l’imprégnation.

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Guide sur l'assurance qualité en

anatomopathologie

Phases pré-analytique et analytique

Comité consultatif en anatomopathologie

Novembre 2011

Page2sur36

Dépôtlégal

BibliothèqueetArchivesCanada,2011

quecesoit,latraductionou d'enmentionner lasource.

©GouvernementduQuébec,2011

Page3sur36

Rédaction

M me M me D r D r

Révisionexterne

decedocument.LesmembresdusousͲ ' M.DenisBouchard,T.M. ' M me

MartineChalifoux,T.M.

' D r ' M.BrunoHoude,T.M.,viceͲprésidentdel'OPTMQ ' M me

CindyLaliberté,T.M.

' M me ' M me

JoséeSenécal,T.M.

' M me

ChantaleTremblay,T.M.

Révisioninterneetadoption

Comitéconsultatifenanatomopathologie

l'UniversitédeMontréal

Mélanie

duRUISdel'UniversitéMcGill decardiologieetdepneumologie pratiquesenoncologie(CEPO)

BrunoHOUDE,technologiste

d'assurancequalitéenpathologieduLSPQ l'UniversitédeSherbrooke

Page4sur36

Résumé

er avril2011,pourrépondreauxbesoins l'améliorationdelaqualité. luttecontre consultatif

En2003,JacquesC.FortieretRené

doiventciblertant

énoncéunesérie

Page5sur36

Tabledesmatières

4.4. 21

5.8.Conservationdesblocs,deslamesetdes

Page6sur36

1. Questionclinique

interneet externedulaboratoire?

2. Miseencontexte

re avril2011,pourrépondreaux surla

Afinderépondreàcemandat,le

lescontrôlesexternes miseenoeuvreduPAQ[3].

Àceteffet,leComité

déterminer externedulaboratoire.

Page7sur36

3. Méthode

janvier2003etnovembre

Notamment,lessites

sélectionnésapermisdecompléter larevuedeladocumentationscientifique.

également

Page8sur36

4. Résultats

' "Histotechnologie:techniquesetprocédés»,deFortieretHould[4]; ' lalisted'accréditationduCAPpourl'anatomopathologie[5]etlesrecommandationspourla ' les ' lesrecommandationsdel'ACPpourlastandardisationdestestsd'immunohistochimie[8]etla ' lesrecommandationsdel'ASCOconcernantlestestsdedéterminationdustatutdesrécepteurs détaildansles sectionsquisuivent.

4.1. FortieretHould

physiquesde

4.1.1. Prélèvementettransportdestissus

lesspécimensbiopsiquesprélevés sontretirésducorps humain. supplémentaire(numérode

Page9sur36

êtreacheminés

adéquatedelatotalitédutissu. vérifierqu'ilyaconcordanceentreles réduirelesrisquesdeconfusionetde donnéepertinente.Laconsultationdes

4.1.2. Fixation

' vitessedepénétration:les ' vitessedelaréactiondefixation:cefacteurestplusdifficileàdéterminer,étantdonnéquela ' volumedefixateur:pourobtenirdesrésultats ' épaisseurdelapiècedetissu:uneépaisseurde3à5mmestconsidéréecommeidéalepourles tissusàfixeraveclesfixateursusuels. ' consistancedes fixateurs.

Page10sur36

' Duréedelafixation:laduréedefixationestcapitale,carellepeutêtreresponsabledeplusieursdes ' Concentration: ' Température:lachaleurmodéréeestsusceptibled'accélérerlafixation. ' pH:ilestconseilléd'employerdesfixateursdontlepHsesitueentre6et8,lesvaleursextrêmes Toute inadéquat.

4.1.3. Circulation

Lacirculationapour

étapes,soitladéshydratation,

l'éclaircissementetl'imprégnation. ladéshydratation,s'assurerque lelaboratoire,noterlemomentdeces lesopérations effectuées,puisdateretparapher.

4.1.4. Inclusion/enrobage

dutissufacilitelaformationderubans. différentesstructuresdutissuen températuredescomposantesdu

Page11sur36

4.1.5. Microtomie

descoupesdépenden typesdemicrotomes. paraffine laboratoireen

4.1.6. Étalement

L'étalementdescoupesconsisteà

tissusureauchaude. fréquemmentlebaind'étalement lesplisquirestentsur dedébristissulaires,etchangelemilieu

4.1.7. Colorationderoutine

decolorationde devérifierrégulièrementau

étapesduprocessus.

notamment: ' lavérificationquotidienneduniveaudeliquidedanschaquebain; ' lefiltragedessolutionscolorantesquotidiennementou tissulaires;

Page12sur36

' l'établissementd'unhorairepourlerenouvellementetledécalagedesbains,considérantqu'ilfaut delamescolorées; ' l'inclusiond'unelametémoindanschaquesériedelamesàcolorer,préférablementdescoupes témoins adéquate; ' lavérificationdelaqualitédelalametémoinaumicroscopeetl'apportdecorrectionslorsque requis; ' latenueàjourd'unregistreindiquantlescorrectionsapportées.

4.1.8. Montagedeslames

Le enplusde résine,selonunanglede

45à90

o

Pourlemontagedeslames,

formationdebullesd'air,

4.1.9. Conservationdeséchantillonsetdesrapports

d'anatomopathologie températuredeconservationrequise. d'anatomopathologie,FortieretHould

4.2. CollegeofAmericanPathologists

suivantes:

Page13sur36

Examendesspécimenschirurgicaux

' DesespacesréfrigéréssontͲilsdisponiblespourlesgrosspécimensnonfixés? ' LescontenantsdesspécimenssontͲilsétiquetésavecauminimumdeuxidentifiants?

' ExisteͲtͲildesprocéduresdocumentéespourlamanipulationdespécimenssousͲoptimaux(p.ex.:

' L'identitédechaquespécimenestͲellemaintenueentouttempslorsdesétapesdetraitementdes

échantillonsetd'examen?

' Lorsquedesindividusautresquelepathologisteoulerésidenttraitentlesspécimens,l'étenduede leursactivitésestͲelledéfinie dansunprotocoledocumenté? ' Lorsquedesindividusautresquelepathologisteoulerésidenttraitentlesspécimens,lanaturedela typedespécimen? ' ExisteͲtͲildesprocéduresécritespourletraitementdes spécimens? ' Deslignesdirectricesouinstructionspourladissection,ladescriptionetl'échantillonnage ' ExisteͲtͲilunepreuvedocumentéedelarevuequotidienneparlepathologistedelaqualité ' Leslames

Contrôlegénéraldelaqualité

' EstͲcequel'identitédechaquespécimenestmaintenueàchaqueétapedetraitementetde préparationdeslames? ' LesblocssontͲilsidentifiésadéquatement? ' LeslamessontͲellesidentifiéesdefaçonpermanente,lisibleetadéquate? ' LelaboratoiredepathologiedocumenteͲtͲille nombredeblocs,delamesetdecolorations préparées?

' LesréactifsetlessolutionssontͲilsadéquatementétiquetésaveclesélémentssuivants:contenuet

' LesréactifssontͲilstousutilisésàl'intérieurdeleurdatedepéremption? ' LesréactifssontͲilstousentreposéstelquerecommandéparlemanufacturier?

Instrumentsetéquipement

' LessolutionsducirculateursontͲelleschangéestelquerequis(intervallesenfonctionduvolume d'activité)? ' LatempératuredesbainsdeparaffinedanslecirculateurestͲellevérifiéerégulièrementet documentée?

Page14sur36

' L'appareild'inclusionestͲilpropreetbienentretenu?

' Latempératuredel'appareild'inclusionestͲellevérifiéerégulièrementetdocumentée?

' LatempératureestͲelleajustéeadéquatementenfonctiondutypedeparaffineutilisé? ' Lesbainsd'étalementsontͲilspropresetbienentretenus,etexisteͲt

Ͳiluneprocédurepourprévenir

' LesmicrotomessontͲilspropres,bienentretenus,lubrifiésadéquatement,selonlecas,etsansjeu excessifdanslemécanismed'avance? ' LeslamesdumicrotomesontͲellesaffutéesetnonstriées?

Rangementetmatériels

' LeslamesetlesblocsdeparaffinesontͲilsentreposésdemanièreorganisée(accessiblesdanslecas seconformeràcesrecommandations,les entreposé.

4.3. Associationfrançaised'assurancequalitéenanatomieetcytologiepathologiques

analytiquedel'histologie: ' Identificationduprélèvement ' Formulairededemanded'examen:cedocumentestindispensable,carilpermetdecolliger,auͲdelà desidentifiantsdu ' Conditionnementettransmissionduprélèvement:L'identificationcorrected'un prélèvementetsa fraisestacheminéselondes

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laboratoire. ' Réceptionetenregistrementduprélèvement:Lepersonnelchargédelaréceptiondisposed'une demandeurs. préͲanalytiquede l'immunohistochimie:

' Délaientreexcision/ponctionetfixation:lesdélaisàlafixationdesprélèvementssontsuffisamment

l'immunohistochimie. ' Fixation

' Coupestissulaires:lescoupestissulairesont3à5ʅmd'épaisseur.Ellessontdéposéessurdeslames

tissuausupport. ' Leslamesetlesblocssontmaintenusdansdesconditionstechniquespermettantleurconservation ' Ilestrecommandédeconserverlesrésidusmacroscopiquesaprèsl'envoidesrapports

4.4. Associationcanadiennedespathologistes

recommandé.

Page16sur36

(20:1)deformoltamponné10%. spécimenaitété

4.5. AmericanSocietyofClinicalOncology

possible. pour retirédupatient,l'heureà rapportd'anatomopathologie. depratiquepourla desixsemainespourlesanalysesde disponible.

4.6. Autrespublications

fixation, devraient recommandés.

Lespièces

nuit.Lescoupes

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immunohistochimiqued'HERͲ2. analytiquesysontdécrites: ' Desprocéduresstandardpourleprélèvement,l'identification,l'acceptation/rejet,l'examen ' Lerenouvellement coloration,dedéshydratation etd'éclaircissementdescoupes. ' L'utilisationrégulièredecontrôlespourlescolorationsderoutineestrecommandée.Pourla ' L'enregistrementdelatempératuredesbainsdeparaffine,dubaind'étalementetdelaplaquede dequalitéstandardetêtre

' Lemicrotomedevraitêtredebonnequalitéetrégulièremententretenu.Lacalibrationpériodiquedu

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