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Polycopie de cours de biologie moléculaire de l'Université Ferhat Abbas. Robert P. Génétique : Ediscience
SUPPORT DE COURS de - GENIE GENETIQUE
Support de cours Génie Génétique. Master de Recherche en Sciences et Technologies (Biologie moléculaire et santé). 1. RAPPELS : LES OUTILS DU GENIE
Cours de Biologie Moléculaire et Génie Génétique
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GENIE GENETIQUE
SUPPORT DE COURS de. GENIE GENETIQUE. LF3. Unité d'Enseignement Génie biologique. ECUE Génie Génétique. Elaboré par : Dr. KHOUAJA Fattouma.
Génie –génétique
Chapitre I : Les outils enzymatiques du génie génétique 3'à5' permet à l'enzyme au cours d'une synthèse d'un fragment d'ADN de contrôler si.
Les enzymes « outils » du génie génétique
Un mélange des ces dernières enzymes permet d'amplifier par PCR des fragments d'ADN de taille allant jusqu'à 50kb. Page 5. Complément de cours de Génie
LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE DADN
Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire réunis peuvent être liés de façon covalente au cours d'une réaction très ...
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Support de cours Génie Génétique Master de Recherche en Sciences et Technologies (Biologie moléculaire et santé) 1 RAPPELS : LES OUTILS DU GENIE
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Matière : Génie Génétique • Objectifs de l'enseignement: Faire comprendre les multiples applications du génie génétique et leurs applications biotechnologiques
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9 avr 2021 · ? La recombinaison de l'ADN in vitro ? Le clonage du gène ? Criblage des clones transformants ? L'expression du gène
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Préparer par Dr ZIANI Mouna Destiné aux étudiants de 3 eme année Licence de Biologie moléculaire 2019/2020 Cours du module Génie –génétique
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Grâce aux recombinaisons des gènes in vitro il devient possible de créer des micro-organismes capables de fabriquer des molécules rares et précieuses (exemple
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Le génie génétique c'est la manipulation du génome d'un organisme par le biais de la d'une cellule par la manipulation de gènes in vitro C'est au
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Université catholique de Louvain - Génie génétique - cours-2022-lbrmc2101 UCLouvain - cours-2022-lbrmc2101 - page 1/3 lbrmc2101 2022 Génie génétique
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Page 1 Cours de base de génétique F BOUCHART Page 2 Biodiversité et génétique Page 3 Page 4 Page 5 Page 6 ADN Page 7
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Génie génétique Licence 3 Biochimie COURS 5: CLONAGE ET VECTEURS DE CLONAGE 1 Réplication autonome et indépendante de l'ADN de la cellule hôte
Quelles sont les étapes de génie génétique ?
Les étapes du processus de génie génétique sont les suivantes (1) isoler le gène d'intérêt, (2) le couper dans la molécule d'ADN, (3) l'insérer dans un vecteur, (4) introduire le vecteur dans une cellule hôte, et (5) sélectionner les cellules qui ont absorbé le vecteur.Quels sont les outils du génie génétique ?
Les outils les plus importants que le généticien utilise en laboratoire sont:
les enzymes: ce sont des protéines qui rendent les réactions chimiques possibles et les accélèrent. Elles sont extraites de micro-organismes.Les véhicules génétiques: ce sont des micro-organismes qui peuvent transférer de l'ADN d'une cellule.Quel est le rôle du génie génétique ?
Le génie génétique est une forme de biotechnologie moderne utilisée pour modifier le génome – ou matériel génétique – d'organismes vivants. Il permet d'ajouter de nouveaux caractères précis à une plante ou à un animal par la manipulation directe de son génome.- Les conséquences environnementales
Ainsi, le génie génétique peut accélérer les effets néfastes de l'agriculture, ou au contraire, contribuer à des pratiques culturales plus durables et à la conservation des ressources naturelles, y compris à la biodiversité.
IGNEMENT SUPERIEUR
UNIVERSITE DE LA MANOUBA
INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)SUPPORT DE COURS de
GENIE GENETIQUE
LF3ECUE Génie Génétique
Elaboré par :
Dr. KHOUAJA Fattouma
Année Universitaire 2019/2020
2Code UE
ECUE n° 2 Génie Génétique
Code ECUE
Chapitre 2. Les Outils du génie génétique1. Les enzymes
1.1. Enzymes de restriction
1.2. Ligases
1.3. Polymérases
1.4. Autres enzymes
2. Les vecteurs de clonages
2.1. Plasmides
2.2. Phages
2.3. Cosmides
2.4. BAC
2.5. YAC
2.6. Autres vecteurs (vecteurs viraux eucaryotes...)
3. Les cellules hôtes
3.1. Bactéries
3.2. Levures
3.3. Cellules animales et végétales
Chapitre 3. Les Méthodes de clonage
1. Vecteurs de clonage
3. Importance des marqueurs de sélection
4. Etapes de clonage et construction des Banques géomplémentaires
5. Sélection et criblage moléculaire
4.1. Méthodes de sélection de clones recombinants
4.2. Techniques de criblage des clones par hybridation avec une sonde
oligonucléotidique marquée 5. Le5.1. Méthode chimique de Maxam et Gilbert
5.2. Méthode enzymatique de Sanger
6. La PCR, RT-PCR, PCR-RFLP et leurs applications
1. Synthèse de substances utiles
2. Diagnostic des maladies héréditaires
4. Transgénèse : Animaux transgéniques et knock-out (intérêts et objectifs, les constructions, la
méthodologie)5. Thérapie génique : Intérêts et objectifs, Les constructions, La méthodologie
3 Planche 1 : carte de restriction du plasmide pBR322Planche 2 : carte de restriction du plasmide
pUC18/19 (MCS : multiple cloning sites = région à sites multiples de clonage) Planche 3 : carte de restriction du plasmide pBluescript II SK 4Dans le site multiple de clonage (MCS) on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des
promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un gène de l'ADN étranger, qu'il soit
inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille de 4 à 6 kbp en moyenne et devant attendre
de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp.Après assemblage in vitro, les cosmides sont capables de se fixer sur la paroi de la cellule hôte et d'injecter
leur ADN. Celui-ci grâce aux extrémités cos se circularise et se réplique comme un plasmide mais aucune
des fonctions phagiques ne peut être exprimée. De ce fait, les cellules survivent et forment des clones.
Planche 4 : C constitution d'une banque
5 ((221155 KKbb))Planche 5 Agrobacterium tumefaciens
" Left border » et " right border » : Bordures gauche et droite de la région T du pTi Ce sont des vecteurs permettant de cloner de grands fragments d'ADN (100 à 300 kb) dans les cellules d'E. coli. Ce sont des ADN circulaires, dont l'origine de réplication (OriS) est issue de l'épisome sexuel F de E. coli. Les gènes " parB » et " parA » de l'épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène " repE » code pour l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. Le gène " CosN » vient du bactériophage . Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. Le gène " CmR » d'origine plasmidique code pour la résistance au chloramphénicol. Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F). Il pénètre dans les cellules hôtes par transformation en présence de chlorure de calcium ou par électroporation. Les vecteurs recombinants sont ensuite sélectionnés sur des clones bactériens. Planche 6 : Les BAC (Chromosome Artificiel de Bactérie) 6Planche 7 : carte fonctionnelle du pYAC
Les YAC sont des vecteurs des cellules
eucaryotes. Ils permettent de cloner de très grands fragments d'ADN (100 à 2000 kb) dans les cellules de la levureSaccharomyces cerevisiae. La pénétration
dans les cellules hôtes se fait soit par transformation en présence d'ions de calcium ou de PEG (polyéthylène glycol) soit par électroporation. 7Planche 8 : 2
Ligation
Incubation en présence de ligase
Produits de ligation
Plasmides intacts
Qui se sont recircularisés sans
Plasmides recombinants
Transformation bactérienne par le produit de ligation C'est-à-dire introduction du plasmide vecteur dans la bactérie hôteObtention de 3 populations de bactéries
pBR322Bactéries non transformées :
AmpS TetS
Bactéries transformées (AmpR Tet?) par :
- un plasmide intact non recombinant : AmpR TetR - un plasmide recombinant : AmpR TetS Le gène de résistance à la Tet est inactivé suite àSélection par étalement des bactéries sur un milieu de culture + Amp AE seules les bactéries transformées vont se développer sur ce 1er
milieu (AmpR Tet?). Ensuite, les colonies apparues sur ce milieu seront repiquées sur un milieu contenant Amp + Tet AE seules
les bactéries transformées par un plasmide non recombinant vont se développer sur ce 2ème milieu (AmpR TetR). les colonies
qui ont poussé sur le 1er et non sur le 2ème sont celles transformées par un plasmide recombinant ((AmpR TetS)
AmpR TetR
AmpR TetS
Boite de pétri
AmpR Tet ?
M. + Amp
M. + Amp + Tet
Repiquage
Digestion BamH1
Vecteur linéarisé
Digestion BamH1 qui donne des
TetR BamHIAmpR Pst1
8Planche 9 :
ADN radiomarquée
c Réplique de la banque : repiquage des clones qui constituent la banque sur plusieurs boites de pétriT empreinte de chaque boite sur
une membrane (ou filtre) de nitrocellulose ou nylon pour fixer quelques bactéries de chaque cloneEmpreinte
Filtre
Boite de
pétri e traitement du filtre par la soude (NaOH) : lyse des bactéries, fixation de dénaturationADN sb
Filtre
f hybridation moléculaireADN / sonde
Solution
contenant les 8 séquences radiomarquéesFiltre
g élimination de tous les hybridés par plusieurs lavagesU révélation de la
radioactivité par autoradiographieFilm révélé au RX
i retour à la boite initiale : le clone recherché est repéré la tache radioactive plasmidique recombinant, couper partie du gène par PCR ou par séquençageLe clone bactérien
transformé par un vecteur recombinant ayant inséré le gène recherché 9Planche 10 : Technique de coupure - réparation
10Planche 11 : Technique du random-priming
11 12 13 -Dénaturation -95°C pour séparer les 2 brins-Hybridation de chaque brin avec une amorce spécifique (50 à 60°C qui dépend du % en GC).
-dénaturation Tmpour un oligonucléotide < 30 nt. La Tm est estimée en utilisant la relation suivante : Tm = 2 (A
+ T) + 4 (G + C) Les 2 oligonucléotides font ~ 15-25nt et doivent avoir des Ta voisines. -Extension ou élongation 14Principe de
Cette technique peut être réalisée sur des produits PCR amplifiés par des enzymes de restriction.PCR ou digestion par
des enzymes de restriction 15Analyse du polymorphisme par RFLP
ouple enzyme/sonde pour détecter une mutation qui supprime ou crée un site de restrictionLes étapes de la technique RFLP
c T à des sites de restriction (ou PCR dans le cas eséparer les fragments de restriction. La révélation au BET ne permet pas de distinguer individuellement
les fragments car ils sont trop nombreux (traînée de coloration le long de la piste de migration =
smeer), en plus il est impossible de repérer les fragments homologues. Pour cela, il est nécessaire
f Transfert selon Southern g Hybridation moléculaire par des sondes ADN marquées (radioactives ou fluorescentes)U Révélation par Autoradiographie.
16 (a) (b (c 3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétisé qui est complémentaire etSens de migration
Sens de migration
3 Sens de synthèse = sens de lecture du brin néosynthétiséHaut poids
moléculaire faible poids moléculaireAmorce ADN simple brin
synthétisé Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP (suite page suivante) 17 (d) (e) (suite): Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger utilisant le ddNTP. (a) Cette technique consiste à la synthèse in vitroamorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides de synthèse modifiés et analogues structuraux de
nucléotides: les didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du groupement OH
hosphate suivant. Une fois de leur incorporation AE (b)Etapes du séquençage selon SangerQuatre réactions sont pré
ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs normaux. Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts
(c)Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (pouvant séparer
(marquage radioactif de la sonde par fluorescence).résultats obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours le plus vite). La lecture de
AE AE AE (d) fluorochromes différentsActuellement, le séquençage est devenu automatisé : " séquençage automatique » qui présente le même
séquençage les plus récentes marquent les 4 types de ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes
spécifiques pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE (vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)) : gel de séquence et les données de séquence sont enregistré grâce à un rayonlaser qui capte la fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la migration des
fragme enregistrée et interprétée dans la banque de données de Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans le même tube (e) : Electrophérogramme de séquençageLes séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu'à
1000 pb pour les appareils les plus performants
18Animaux transgéniques et knock-out
Figure 1 . Le génotype commande le phénotype Figure 2 . La technique du Knock Out consiste en le remplacement des deux copies d'un gène, dans le génome de l'organisme, par un autre allèle (le plus souvent, inactif)Figure 3 . Il est nécessaire de disposer du gène à invalider et des séquences le bordant dans le
génome avant de pouvoir procéder à son invalidation 19La technique d'invalidation d'un
gène se base sur la recombinaison homologue : On peut ainsi remplacer le gène complet, présent dans le génome de l'organisme, par une version suffisamment incomplète du gène pour qu'il ne s'exprime pas, ou par un autre gène (ce qui permet de suivre l'expression du gène invalidé). Figure 4 . Un exemple de méthode pour invalider un gène : le remplacer par un autre gène, par exemple un gène "rapporteur" tel que le gène lac Z (qui code pour la ß-galactosidase) La description suivante est faite chez la souris. Elle est valable pour tout organisme Mammifère. Figure 5 . Un exemple de vecteur de recombinaison homologue : plasmide bactérien portant legène lac Z (qui remplace le gène invalidé), avec en amont et en aval des séquences qui entourent
le gène à invalider dans le génome de l'organisme 20Figure 6 . Réalisation de cellules ES modifiées. A. Un vecteur a été réalisé : plasmide portant le
gène lac Z (dans notre exemple), entouré des cellules bordant le gène A dans le génome. Ce
vecteur est introduit dans des cellules ES (transfection). B. Dans quelques cellules ES, un
évènement de recombinaison homologue a lieu : grâce à une reconnaissance des séquences
communes entre le vecteur et le génome de la cellule, une copie du gène A est remplacée par la
construction portée par le vecteur (ici, le gène lac Z). C. La majorité des cellules ES n'ont en fait
pas réalisé cette recombinaison homologue. Les quelques cellules ES qui l'ont réalisée sont
sélectionée, multipliées, et vont permettre la suite du protocole. Figure 7 . L'injection de cellules ES recombinées dans de très jeunes embryons de souris (cescellules s'intègrent à l'embryon) permet l'obtention d'individus mosaïques, dérivant pour partie
de cellules non modifiées, et pour partie de cellules recombinées 21Figure 8 . Le croisement d'une souris mosaïque (dont les cellules sexuelles dérivent des cellules
ES recombinées) avec une souris sauvage ne possédant pas cette mutation permet d'obtenir, pour50% de la descendance, des souris hétérozygotes pour cette mutation.
Figure 9 . Le croisement des hétérozygotes obtenus précédemment entre eux permet l'obtention
(dans la proportion de 1/4 de la descendance) d'individus homozygotes : ce sont les individus "KO", chez qui le gène a été invalidé 22Figure 10 . L'invalidation d'un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de
l'organisme, par une version modifiée, inactive de ce gène. Dans cet exemple, le gène A estremplacé par un autre gène, lac Z. Ce remplacement est permis par la présence de séquences
identiques entre la construction et le génome de l'organisme, au niveau desquelles peut se
réaliser une recombinaison homologueFigure 11 . Bilan : différents résultats sont obtenus, grâce à la recombinaison homologue, en
fonction de la construction réalisée au départ : Knock Out (invalidation du gène), Knock In
(remplacement par un autre gène), ou mutagenèse dirigée (remplacement par un allèle muté).
2323
Fig 1 : Essais cliniques approuvés de thérapie génique dans le monde Fig 2 : Essais cliniques de thérapie génique Méthodologie de la TG moyennant des vecteurs viraux : Une méthode en 4 étapes :
Etape c
Grâce aux connaissances relatives au génome humain, on parvient facilement et rapidement à isoler un gène et à le cloner (PCR) cellule-cible Le vecteur généralement utilisé est un virus : adénovirus et rétrovirus. Thérapie génique Intérêt, objectifs, constructions et méthodologie 2424
Pour produire ces vecteurs viraux, Ces ¢
expriment, normalement, les protéines virales formant la capside de façon stable. En thérapeutique conduit à la formation de particules virales complètes contenant vecteur. Étape e : Administration du vecteur (3 protocoles ),De nombreux essais cliniques de thérapie génique ont utilisé une stratégie de protocole dite ex
vivo, c'est-à-direde transfert du gène thérapeutique en dehors de l'organisme. Les cellules sont ensuite
réinjectées au patient. Cela permet aux chercheurs dans certains cas d'évaluer l'ampleur de la
modification génétique tant au niveau du pourcentage de cellules modifiées génétiquement qu'au
niveau de l'expression des protéines thérapeutiques, ou de présélectionner des populations
cellulaires particulières (ex.: les cellules souches sanguines). Néanmoins, certaines stratégies,
notamment celles visant à éliminer des tumeurs, ou celles visant à modifier génétiquement des
cellules qu'on ne peut manipuler hors de l'organisme, utilisent une approche dite in vivo en
injectant directement le vecteur dans le tissu ciblé et en le laissant agir librement. 2525
la thérapie génique ex vivo :
prélever sur le patient les cellules cibles, les modifier génétiquement avec le vecteur viral
porteur du gène d'intérêt thérapeutique, puis à les réintroduire chez le patient. Cette
méthode est en particulier utilisée pour les cellules sanguines, faciles à prélever et à
réintroduire. la thérapie génique in situ : le vecteur de transfert est directement injecté au sein du tissu cible la thérapie génique in vivo :elle consiste à injecter le vecteur portant le gène d'intérêt thérapeutique directement
dans la circulation sanguine, celui-ci devant atteindre spécifiquement les cellules ciblesÉtape f
Pour infecter une cellule, la particule virale
se fixe d'abord à la membrane cellulaire. Les gènes viraux sont libérés dans le noyau et, qu'ils soient intégrés ou non au génome cellulaire, ils utilisent la machinerie de réplication de la cellule pour produire de nouvelles particules virales. Ces dernières pourront aller infecter d'autres cellules. Lorsque le virus est modifié pour être utilisé comme vecteur de transfert, les gènes codant pour les protéines virales sont remplacés par le gène d'intérêt thérapeutique. Ce vecteur pénètre dans la cellule de la même façon que le virus naturel.Il permet la synthèse de la protéine
d'intérêt thérapeutique, sans production de particules virales.quotesdbs_dbs13.pdfusesText_19[PDF] biologie 3eme pdf
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