[PDF] Génie –génétique Chapitre I : Les outils enzymatiques

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People's Democratic Republic of Algeria

Ministry of Higher Education and Scientific Research

Hassiba Ben Bouali University of Chlef

Faculty of Natural and Life Sciences

Biology department

Préparer par

Dr. ZIANI Mouna

Destiné aux étudiants de 3emeannée Licence de Biologie moléculaire

2019/2020

Cours du module

Génie génétique

Sommer

Chapitre I : Les outils enzymatiques du génie génétique

1. Les enzymes de restriction.

2. 1.

2. on en phase liquide.

3.

4. in situ

Chapitre III : Les vecteurs

1. Généralités sur les vecteurs.

2. Les plasmides

3. Les phages.

4. Les autres types de vecteur

Chapitre IV : Les sondes.

1. Le concept de sonde.

2. Les agents de marquages

3. Quelques stratégies de marquage

Chapitre V: Le clonage

1. Le principe du clonage.

2. 3. 4.

Chapitre VI : La transformation génétique

1. Transformation par canon à particule.

2. Transformation par Agrobacterium tumefasciens

Chapitre VII: Génie-génétique et applications Chapitre I -les outils enzymatiques du génie génétique

I-Les enzymes de restriction :

Généralités

Découvertes à partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître

spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils

permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site

désiré. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les

extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique : on parle

dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de

quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés: ils reconnaissent une

grande variété de sites de coupure.

Les enzymes de restriction sont utilisés pour établir une carte de restriction de toute molécule

d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction

le long de cette molécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule,

des fragments de tailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse.

-à-dire des

Le phénomène de restriction :

Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement

des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la

-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-

séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases. Il faut

remarquer que dans les ADN, on rencontre statistiquement des séquences reconnues par des avec une fréquence statistique de 1 / 256 paires de bases (1/ 44). En effet, la fréquence de striction donnée peut être approchée statistiquement Bam HI, on aura donc une fréquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les

4096 nucléotides.

Origine des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries.

Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des

enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers. Pour éviter une

autodestruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de

restriction par une modification des sites de restriction correspondants.

Nomenclature des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte maj caractérisation de ces enzymes.

Exemples:

Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC Sma I Extraite de Serratiamarcescens site reconnu: CCC / GGG Pst I Extraite de Providenciastuartii site reconnu: CTGCA / G

La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de

reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000

paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de

reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.

Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les

appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des fragments dont les extrémités sont différentes.

Exemple :

Soit la sé

Kpn I:

-G-G-T-A-C/C- -C/ C-A-T-G-G-

Acc65 I:

-G/G-T-A-C-C- -C-C-A-T-G/G-

Ces enzymes sont des isoschizomères, elles reconnaissent en effet la même séquence

nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrémités des fragments obtenus

diffèrent. Types de coupures realisées par les enzymes de restriction. Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs et la coupure à bouts collants. La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La

coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de

de restriction donnée, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position différente sur

Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction.

de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de

méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le

ion aboutit à une

une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes

sont très spécifiques. Les méthylations dans le génome des eucaryotes concernent les cytosines impliquées dans les

insensible à la méthylation des cytosines et une autre enzyme sensible à la méthylation des

cytosines.

Utilisations des enzymes de restriction.

Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire. Par exemple, elles perme comme un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher des mutations dans le génome.

les méthylations de bases. Ces méthylations ont une signification complètement différente des

méthylations de bases observées chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des II- :

II-1.les polymérases :

Propriétés générales

suivantes:

- Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides

triphosphates (dNTPs).

Les enzymes recopiant un ADN en ADN

Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes: - -OH libre. e E. Coli) et le fragment de klenow

Comme exemple-

exonucléasiques. Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les

possède les deux activités exonuc une seule chaîne polypeptidique. synthèse in vitro de ce cours.

Exemple2 La Taq polymérase

La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources

chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures

usuelles (ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée

Les enzymes recopiant un ARN en un ADN

Exemple1 la rétrotranscriptase ou transcriptase inverse

Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer

mARN).

Elle possède les propriétés suivantes:

- Elle est ARN-dépendante. donc insérer des bases par erreur. - Elle a une activité RNAse.

Les enzymes recopiant un ADN en un ARN

suivantes: - Elles synthétisent le brin polymérases). - Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les autres polymérases) des ions Mg2+. - El - Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent correspondant.

II.2.Les ligases

Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement extrémités cohésives). Elles sont extraites de bactéries. Il existe ADN et ARN ligases.

II.3.Les nucléases :

La DNase

endonucléase qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+).

La nucléase S1

en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN. II.4. Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.

Enzymes enlevant des groupes phosphates

Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH

Enzymes ajoutant des groupements phosphates

préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.

Chapitre II : Hybridation Moléculaire

I- : I- HVW

l'effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons hydrogènes (liaisons faibles) et

la séparation des 2 chaînes entraîne une augmentation dans l'absorption d'U.V de 40% à 260

nm.

Figure N°1 :

I-2 / Facteurs influençant la température de fusion : Plusieurs facteurs peuvent influencer la valeur de la Tm :

1. la composition en bases : grâce

bases sera un facteur non négligeable dans le calculde la Tm. De manière générale, on note

que la relation entre la composition en G+C et la Tmets de nature linéaire pour des ADN de longueurs identiques ou suffisamment longs (> 100pb) :Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C) Mais en

pratique, pour les oligonucléotides (duplexes deparfaits de 11 à 20 bases), on utilise plutôt la

formule : Tm = 2(A+T) + 4(G+C) dont ilfaut retrancher 1°C par motif AA, AA, ou TT et ajouter 1°C par motif GG, GC ou CC.

2. les mésappariements :

valeur de 1% de mésappariement. 3. faibles concentrations, la Tm diminue. Cette diminution est de 15°C pourune unité logarithmique de concentration ionique. Les cations divalents ont un effetencore plus hybridations. Dans ce cas, la Tm est estimée selon la formule suivante(pour 100 pb) : ǻ -0,6 x (% formamide).

4. la longueur des fragments des ADN :

variation de température de fusion est donnée par la relation suivante :ǻ-500/nombre de pb.

progressif et lent, il y aura réassociation progressive des deuxbrins complémentaires de

spontanément et de façon spécifique et réversible à une autremolécule monobrin si celle-ci lui

est complémentaire .Cette réassociation peut

ADN/ARN bridation(ADN simple brin, ADN

double brin et hybride ADN/ARN) se fait par centrifugation dans ungradient de concentration de chlorure de Césium. nucléiques est aléatoire. Cependant, sgrande, le nombre de copies hybridées sera grand. Il en résulte donc que la vitesse la concentration même pour le facteur temps : la probabilité ation des brins complémentaires est importante lorsque le temps est long. n est quantifiée en fonction de ces deux variables prises ensembles. Dans le cas des ADN, cette variable est nommée le CoT, pour le cas des hybrides ADN/ARN, elle est dite le RoT: Figure N°2 : Courbe de détermination du Cot et duRot La température : elle favorise la rencontre des deux séquences complémentaires,donc la des températures inférieures à 25% de la Tm de la moléculeconsidérée. La taille du fragment nucléique : Dans le cas où les deux séquencescomplémentaires sont parfaitement identiques, la vitesse de réassociation de ces deux brins augmente proportionnellement avec la racine carrée de la longueur desfragments considérés.

La nature des acides nucléiques : La vitesse de réassociation dépend à la fois de lanature

faible que la réassociation ADN/ADN. En revanche, si réassociation sera identique à celle de ADN/ADN. La force ionique : la concentration en NaCl joue un rôle important dans lesréassociations des segments complémentaires. Pour une concentration de NaCl quiavoisine 1M, la vitesse de -delà, la force ionique sera sans effet. II

II-1/ Hybridation en phase liquide :

Les segments complémentaires sont placésdans une solution contenant un tampon et de la formés sont quantifiés selon troisméthodes :

1. les méthodes spectrophotométriques (la diminution en DO à 260nm est due

2. la technique de la nucléase S1 (digestion des ADN et ARN simples brins)

3. La chromatographie sur hydroxylapatite

forte concentration en sels).

II-2/ Hybridation sur support solide :

La séquence complémentaire cible est fixée(immobilisée) sur un support solide. Cette

méthode facilite la séparation des fractionshybridées de celles non hybridées. Cependant, la

La nitrocellulose :

fixation des acides nucléiques. Ce support, requiert une forte concentrationionique, ce qui permet de créer des liaisons irréversibles sous vide et à 80°C. Les membranes synthétiques (à base de nylon) : De même, elles nécessitent desforces ioniques fortes. Ces membranes permettent des liaisons plus stables que cellesobtenues avec la nitrocellulose à cause de leur traitement par les rayons UV courts(254 nm). Ce type de liaison, va permettre plusieurs déhybridations et réhybridations.

II-3/ Hybridationin situ (HIS):

dans des cellules ou des tissus, desséquences d'acides nucléiques connues. Elle est très proche,

dans son principe, duSouthern et du Northern Blot et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acidenucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire

d'acides nucléiquesque l'on cherche à identifier et à localiser. A la seule différence que les

Southern et NorthernBlot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologiquede tissu. sation des gènes sur deschromosomes en métaphase et la recherche de bactéries qui ont intégré un plasmide ou unphage recombinant.Plusieurs sondes peuvent être utilisées pour réaliser une HIS :

Tableau N°1 : Exemples de marquage des sondes

Marquage Révélation

sondes chaudes

Isotopes radio-actifs (tritium H3, P32,

P33ou S35)

Autoradiographie

Sondes

froides

Produits fluorescents (FISH : Fluorescent In

Situ Hybridization) : Le FISH est une

technique decytogénétique permettant de voir des éléments àl'intérieur de la cellule.

Microscopie à

fluorescence

Haptènes: biotine dioxygénine Avidine et

streptavidine

Anticorps marqués

par un enzyme

Enzymes (phosphatase alcaline) : Anticorps ou

chromogènes

Chapitre III : Les vecteurs

1-Généralités sur les vecteurs

1-1 Concept et rôle :

Un vecteur est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour produire de

Ils sont spécialement conçus pour accomplir plusieurs rôles :

à cloner.

Permet la sélection des cellules recombinantes

1-2Propriétés des différents types de vecteurs

Vecteurs de clonage

une cellule hôte. gène) pour introduire dans une cellule-

II- Les Plasmides

Définition :

Mcirculaire capable de se multiplier de manière autonome dans un organisme procaryote ou eucaryote.

Possède au minimum une origine de réplication et des gènes conférant un avantage à la

bactérie. - Réplication aut - Taille élevée (90 kb pour plasmide R1) - Résistance aux antibiotiques souvent portée par des transposons (Tn3 pour plasmide R1) - Nombre de copies variables suivant les plasmides :

Les plasmides utilisés comme vecteur en génie génétique sont des hybrides et ont été modifiés

par rapport aux originaux.

II-1 les différents types de plasmides

II-1-1plasmide de première génération : Plasmide pBR322

Le pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de première génération,

partiellement construit par génie génétique.Fut construit par Bolivar et Rodriguez 1979. Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire double brin de 4361 paires de bases. Par

convention le nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction EcoR I en

direction du gène tetr.

Il contient une origine de réplication (2535), un gène de résistance à la tétracycline

(tetr 86-r 4153-3293). Le gène ampr ȕ-lactamase) de 286 acides aminés capable de cataboliser cet antibiotique. Le plasmide contient de nombreux sites de restriction répartis sur toute la séquence. ADN linéaire. Exemple, le site BamH I (position 375) au début du gène tetr. La digestion par BamH I permet de recombiner le vecteur avec un fragment de digestion par BamH recombinant feront la réplication du plasmide au cours de leur croissance. Elles nr

Figure 3 : Le plasmide pBR322

II-1-2Plasmides de secondegénération

De nouvelle génération de plasmides plus puissants sans cesse croissantes ont été développés

de seconde génération). Les vecteurs de clonage de seconde génération ce sont des petits - un fragment du plasmide pBR322 (AmpR) - une origine ColE1 mutée dans le gène rop - un site de polyclonage : Le polylinker est inséré dans le gène lacZ qui intervient dans le catabolisme du lactose L'utilisation d'un inducteur coloré comme le X-gal (5-bromo-4chloro-3-indonyl-ȕ-D- galactoside), l'hydrolyse de ce dernier en dibromo-5,5-dichloro-4, 4-indigo (de couleur bleu),

ȕ-galactosidase.

Figure 4 : La carte génétique de certain vecteur de type pUC dérivés de pBR322. Le site de

clonage multiple (polylinker) est introduit dans le gène lacZ, sans interrompre la fonction du gène

III-Les phages

III-1.Définition et Utilisation des phages :

Les phages présentent deux intérêts essentiels par rapport aux plasmides : - infection spontanée bactérie.

II-n phage :

1- Produire une grande quantité de phage, la purifier, puis en extraire son ADN génomique,

qui sera digéré par une enzyme de restriction.

2- Hybrider les deux bras du phage avec le fragment d'ADN à cloner (ce dernier doit avoir

une taille adéquate) puis souder par l'ADN ligase.

3- Procéder à l'encapsidation in vitro de l'ADN recombinant en ajoutant les protéines

phagiques de tête et de la queue. Ces derniers ils vont s'auto assembler pour former les

nouveaux virions recombinants infectieux.

4- Infecter des bactéries (cellules hôtes) et les étaler sur boite de Pétri, chaque plage de lyse

correspond à un phage recombinant qui peut être récupéré.

5- Vérifier la présence d'un insert dans l'ADN recombinant par toute procédure appropriée

(hybridation ADN-ADN, séquençage, test bleu-blanc etc.) III-3 .Les différents phages utilisés en biologie moléculaire : III-3-1. Les phages de première génération : le phage Ȝ - le phage lambda a un génome de 48 Kb

- sur les 50 gènes, beaucoup sont impliqués dans la recombinaison et la lysogénie et ne sont

pas essentiels à la multiplication du phage et au cycle lytique.

- les vecteurs dérivés de lambda qui sont utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de

Figure 5 : vecteur dérivés du bactériophage lambda. III-3-2. Les phages de seconde génération : Bactériophage M13

Le génome du phage M13 est

Le M13 à des dérivés contenant une partie du gène lacZĮ (MCS: multiple cloning site) de 13 sites uniques de restriction (54pb). Ce qui permet d'insérer des fragments d'ADN dans ces sites, et la sélection des colonies blanches sur des boites contenant l'analogue X-gal. Le phage M13 et ces dérivés peuvent être utilisés : - Pour séquencer des fragments d'ADN même de séquences inconnues par la technique de

Sanger.

- Pour le clonage des fragments d'ADN de taille jusqu'à six fois plus grand que l'ADN viral. - . coli. - Dans la mutagénèse dirigée.

IV. Les autres types de vecteur :

VI-1Les cosmides

part et - gènes de résistance et origine de réplication du plasmide

Intérêt :

Les cellules transformées sont sélectionnées sur un milieu contenant de l'antibiotique

(ampicilline).Comme conclusion les cosmides permettent : - L'encapsidation d'un plasmide modifié (recombinant) dans un virion.

- D'obtenir des rendements d'intégration bien supérieure à ceux que donne une transformation

bactérienne par un plasmide. - Le clonage d'un fragment d'ADN plus grand (de 32 à 47 kb) que celle véhiculé par un - Nécessite moins de clones pour créer une banque génomique. - Les cosmides sont plus stables que les plasmides Figure 4: Schéma d'un cosmide, dans le site multiple de clonage on a placé de part et d'autre du site de clonage BamHI, des promoteurs phagiques afin de pouvoir transcrire et traduire un

gène de l'ADN étranger, qu'il soit inséré dans un sens ou l'autre. Un cosmide ayant une taille

de 4 à 6kbp en moyenne et devant attendre de 38 à 54 kbp pour son assemblage automatique a donc une capacité de l'ordre de 45 kbp. Figure 5: L'empaquetage in vitro d'un cosmide recombinant.

VI.2. Les vecteurs " navette » :

Les vecteurs navettes peuvent transporter un ADN cloné entre deux organismes différents et se répliquer de manière stable dans chacun d'eux. On utilise des vecteurs navettes capables de se répliquer et de se maintenir à la fois chez E. coli et chez la levure Ils sont de trois type: intégratifs, centromériques ou épisomales les vecteurs intégratifs (YIp): - Ce sont des vecteurs dtype pBR322, contenant un marqueur de sélection de levure. -de la levure pour être propagé

Figure 6: Vecteurs intégratifs (YIp5)

les vecteurs épisomales (YEp) -Ce sont des vecteurs dtypepBR322, contenant un marqueur desélection de levure. -Ils sont propagés de façon stableavec 20 à 50 copies/cellule.

Figure 7: Vecteurs épisomales (YEp24).

Les vecteurs centromériques(Ycp):

-Ce sont des vecteurs dtype pBR322, contenant un marqueur de sélection de levure. -Ils contiennent une origine de réplication chromosomique ARS (autonomouslyReplicatingSequence) et le centromère CEN des chromosomes de levure -Ils sont propagés avec un faible nombre de copies (1).

Figure 8: Vecteurs centromériques (Ycp50)

VI.3 Les vecteurs viraux eucaryotes :

" Vecteurs réplicatifs

Vecteurs se répliquant de manière autonome

en thérapie génique Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à Exemples : Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères " Vecteurs non réplicatifs Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant les gènes essentiels à la réplication délètés dans la construction du vecteur Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique Exemples : Adénoviraux : Ad2 & Ad5 et Rétroviraux : MLV, lentiviraux ( HIV).

Chapitre IV : Les Sondes

I-Concept de sonde

hybridation et de marquer cette séquence pour permettre son identification ou son isolement.

II-Les agents de marquages

Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde le marquage dit 'chaud' utilisant des isotopesquotesdbs_dbs33.pdfusesText_39

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