[PDF] LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE DADN

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LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE D'ADNLe génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire permettant d'isoler des

gènes spécifiques, de les reconstruire puis de les réinsérer dans des cellules ou des organismes. Ces

techniques ont fourni à la médecine et à l'industrie un moyen efficace de produire en grandes quantités

des protéines spécifiques, qui, auparavant, n'étaient disponibles (si elles l'étaient) qu'en quantité

extrêmement faibles. Ces techniques ont permis également d'étudier la régulation de leur expression et

ainsi de mieux comprendre le développement de maladies génétiques.

Les différentes étapes passent par : la construction d'une banque d'ADN, le criblage de la banque et

l'expression du gène.I. Construction d'une banque d'ADN : clonage de gène.

On peut distinguer 2 méthodes permettent de construire une banque d'ADN. La première consiste à

fragmenter la molécule d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction, la seconde consiste à purifier de l'ARN

messager qui seront ensuite transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par une transcriptase inverse. I.1. Préparation d'une banque d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction : banque d'ADN génomique.

1.1.1.Préparation de l'ADN.

Les enzymes de restriction (voir polycopié introduction au génie génétique) sont des nucléasse purifiées

à partir de bactéries qui coupent l'ADN au niveau de séquences spécifiques de 4 à 8 nucléotides,

produisant des fragments d'ADN de tailles strictement définies, les fragments de restriction.

Les enzymes de restriction sont utilisées pour produire de petits fragments d'ADN renfermant un gène

particulier. Une autre propriété des enzymes de restriction, commode pour le clonage des gènes, est la

capacité, pour beaucoup d'entre elles, de provoquer des coupures en " zig-zag » qui laissent de

courtes extrémités monocaténaires aux 2 extrémités du fragment d'ADN : les extrémités cohésives.

Ces extrémités peuvent former des paires de bases complémentaires avec n'importe quelle autre

extrémité produite par la même enzyme. Ainsi, cela permet de relier 2 fragments d'ADN double hélice

provenant de génome différents par appariement de bases complémentaires.Les extrémités cohésives produites par de nombreux types de nucléases de restriction permettent de

relier deux fragments d'ADN par des appariements de hases complémentaires. Les fragments d'ADN ainsi

réunis peuvent être liés de façon covalente au cours d'une réaction très efficace catalysée par t'ADN

ligase. Dans cet exemple, une molécule d'ADN recombinant de plasmide contenant une insertion d'ADN

chromosomique est formée. Par exemple, un fragment d'ADN contenant un gène humain peut être relié au chromosome d'un virus bactérien en tube à essai. La nouvelle molécule d'ADN recombinante peut ensuite

être introduite dans une cellule bactérienne. Sachant que le mécanisme de réplication normal

d'un virus peut engendrer plus de 1012 molécules d'ADN viral identiques en moins d'un jour,

l'ADN humain est ainsi considérablement amplifié. Le virus est appelé vecteur de clonage.I 1.2. Les vecteurs de clonage.Un vecteur de clonage est une petite molécule d'ADN qui possède les propriétés suivantes :

pouvoir se répliquer dans une bactérie fortement amplifiable posséder des sites de restriction

permettant d'introduire le fragment d'ADN à cloner posséder 2 types de marqueurs : marqueurs

de transformation qui permet de faire la distinction entre des bactéries transformées

(ayant reçu le vecteur) et les autres marqueurs de recombinaison qui permet de faire la

différence entre des bactéries ayant reçu le vecteur seul de celles ayant reçu le vecteur

recombinant (c'est à dire avec l'ADN d'intérêt).Il existe 3 types de vecteur de clonage : plasmidiques, viraux et cosmides (phage associés à des

plasmides). Les-vecteurs plasmidiques de première génération sont dérivés du plasmide

pBR322.Actuellement, on utilise préférentiellement des vecteurs plasmidiques de seconde génération :

le plasmide pUCIS et ses dérivés.Parmi les vecteurs viraux, un des plus classiques est celui du bactériophage M13.I 1.3. Insertion dans les vecteurs de clonage.Les principes fondamentaux des méthodes utilisées pour cloner des gènes sont les mêmes pour

les différents types de vecteurs, bien que les détails techniques puissent être différents.Pour simplifier, nous n'exposerons que les méthodes utilisées pour les vecteurs plasmidiques.Quand on dispose de plasmide purifiés (voir TP purification de plasmides), les ADN circulaires

de plasmides sont tout d'abord coupés par une nucléase de restriction afin de créer des

molécules d'ADN linéaires.Par ailleurs, l'ADN génomique utilisé pour constituer la banque est lui aussi coupé par la même

nucléase et les fragments de restriction résultants sont alors ajoutés aux plasmides coupés et

réassociés pour former des ADN circulaires recombinants. Ces molécules recombinantes contenant des insertions d'ADN étrangers sont ensuite scellées de façon covalente par l'ADN

ligase (voir polycopié introduction au génie génétique) pour former des ADN circulaires intacts.

Il faut alors indiquer qu'à cette étape, certains plasmides sont refermés sans aucune molécule

d'ADN étrangère.I. 1. 4. Transformation des cellules Dans l'étape suivante de préparation de la banque, les molécules d'ADN recombinantes ainsi préparées sont introduites dans des cellules (habituellement des bactéries ou des levures, parfois d'autres cellules eucaryotes) qui ont été rendues perméables à l'ADN de façon

transitoire. De telles cellules sont dites alors transformées par les plasmides (on parle aussi de

transfection de cellules, voir TP transfection de cellules eucaryotes in vitro).Pour faciliter l'introduction d'un gène dans une bactérie, il faut rendre les bactéries compétentes

en fragilisant leur paroi cellulaire. C'est ce que l'on fait par exemple lorsque l'on plonge des bactéries Gram - dans une solution froide de CaCl2 (50 mM). Ce procédé permet à l'ADN

extérieur de se fixer sur la paroi cellulaire. L 'entrée de l'ADN est ensuite stimulée par une brève

incubation à 42 °C.Pour les cellules eucaryotes, on a recours à des molécules comme le DEAE-dextran ou le

phosphate de calcium qui fragilise la membrane cellulaire et favorise la formation de pore par lesquels les vecteurs plasmidiques peuvent pénétrer (voir poly transfection d'un vecteur d'expression eucaryote dans des cellules de mammifère). Lorsque les cellules se divisent et se multiplient, les plasmides recombinants se répliquent

également pour produire un très grand nombre de copies d'ADN renfermant l'ADN étranger.I. 1.5. Sélections des cellules transformées

Les vecteurs utilisés portent des marqueurs de transformation. Dans le cas des plasmides, il

s'agit de gènes de résistance aux antibiotiques. Ainsi, si des bactéries transformées avec ce

plasmide arrivent à cultiver sur un milieu contenant l'antibiotique, c'est que ces bactéries

initialement sensible à l'antibiotique sont devenues résistantes. Seule l'intégration du plasmide

porteur du gène de résistance peut expliquer l'apparition soudaine de cette résistance. Ces bactéries contiennent la banque d'ADN.Cependant, parmi ces bactéries transformées, certaines peuvent avoir reçues le plasmide

sans ADN étranger, d'autres possèdent un plasmide recombinant et parmi ces dernières,

seules une infime minorité peuvent posséder le plasmide recombinant qui contient le gène que

l'on veut isoler. Il faut être capable d'identifier ces cellules afin de récupérer FADN intéressant

sous forme pure et en quantité suffisante.I. 1.6. Sélection des clones intéressants dans une banque d'ADNLa sélection des rares colonies de la banque qui contiennent le fragment d'ADN intéressant est

souvent la partie la plus délicate du clonage des gènes.Une des techniques fréquemment utilisée est une forme d'hybridation in situ qui se sert de

l'extrême spécificité des interactions d'appariement entre 2 molécules d'acide nucléique

complémentaires.Des boites de cultures contenant les colonies bactériennes en croissance sont transférées

avec un morceau de papier filtre, auquel quelques bactéries de chaque colonie adhèrent. Ces

bactéries sont ensuite traitées afin de faire éclater les cellules et de dénaturer l'ADN du

plasmide puis hybridées avec une sonde radioactive contenant une partie de la séquence de

l'ADN du gène d'intérêt.Les colonies bactériennes qui ont fixé la sonde sont identifiées par autoradiographie.Une technique efficace couramment utilisée pour trouver une colonie bactérienne portant un clone d'ADN

particulier (voir aussi Figure 5-79). Chaque cellule portant un plasmide recombinant se développe en une

colonie de cellules identiques, visible sous la forme d'un point blanc sur l'agar. Une réplique de la culture

est ensuite réalisée en appuyant un morceau de papier absorbant sur la surface. Cette réplique est

traitée à l'alcali (afin de faire éclater les cellules adhérentes et de dénaturer l'ADN du plasmide) puis

hybridée avec une sonde d'ADN très radioactive. Les colonies bactériennes qui ont fixé la sonde sont

identifiées par autoradiographie.Il est alors possible de reprendre la colonie bactérienne correspondante, de l'inoculer pour

une culture de grande ampleur et de purifier les plasmide recombinant.

Purification et amplification d'une séquence d'ADN spécifique par clonage de l'ADN dans une bactérie.Remarques : de nombreuses techniques peuvent être utilisées pour vérifier que le gène cloné

dans un vecteur correspond à un gène d'intérêt : séquençage d'ADN, contrôle de taille par

électrophorèse sur gel d'agarose, etc...I.2. Préparation d'une banque d'ADN à partir d'ARNm : banque d'ADNc.Le clivage de la totalité du génome d'une cellule avec une nucléase de restriction spécifique

pour le clonage d'un gène est parfois qualifié de pêche à la ligne En effet, on obtient des

millions de fragments d'ADN qui produit des millions de colonies différentes de cellules

transformées.Une autre stratégie possible est de commencer le processus de clonage en sélectionnant les

seules séquences d'ADN qui sont transcrites en ARN et qui sont donc supposées correspondre

à des gènes : les ARN messagers.Cette méthode consiste à extraire l'ARNm à partir des cellules et à faire ensuite une copie

d'ADN complémentaire (ADNc) de chaque molécule d'ARNm présente grâce à une

transcriptase inverse.La transcriptase inverse (ou reverse) isolée des rétrovirus est capable de catalysée la synthèse

d'une chaîne d'ADN à partir d'une matrice d'ARN. Les molécules d'ADN monocaténaires synthétisées par cette enzyme sont ensuite converties en molécules d'ADN bicaténaire par

l'ADN polymérase.Ces molécules d'ADNc sont ensuite insérées dans des plasmides et clonées comme

précédemment. On obtient alors une banque d'ADNc.Une copie d'ADN (ADNc} d'une molécule d'ARNm es! effectuée par la transcriptase reverse (voir p.

254), une enzyme virale qui utilise une chaîne d'ARN comme matrice pour la synthèse d'une chaîne

d'ADN complémentaire, formant ainsi une hélice hybride ADN/ARN. Le traitement de l'hybride ADN/ARN

avec un alcali dégrade sélectivement la chaîne d'ARN en nucléotides. L'ADNc monocaténaire restant

est alors copié en ADNc bicaténaire par l'ADN polymérase. Comme l'indique la figure, la transcriptase

reverse et l'ADN polymérase requièrent toutes les deux une amorce pour commencer leur synthèse.

Pour la transcriptase reverse, un petit oligonucléotîde est utilisé ; dans cet exemple, l'oligo(dT) a été

associé au poly A à l'extrémité 3' de la plupart des ARNm (voir p. 528). Noter que la molécule d'ADN

bicaténaire produite ici ne possède pas d'extrémités cohésives ; de telles molécules d'ADN à extrémités

" tronquées » peuvent être clonées par un seul ou plusieurs procédés analogues à celui que montre la

Figure 5-78, mais moins efficaces. Par exemple, des oligonucléotides synthétiques qui contiennent des

sites de coupure par les enzymes de restriction peuvent être liés aux extrémités d'ADN, ou des "

queues » d'ADN monocaténaires peuvent être additionnées par voie enzyrnatique pour faciliter

l'insertion d'une molécule d'ADNc dans un vecteur de clonage.II. Expression des gènes clones dans les microorganismes.Quand on dispose d'une banque d'ADN d'intérêt (banque génomique ou banque d'ADNc) dont

on a vérifié que le gène clone est celui que l'on veut faire exprimer, il faut alors transformer à

nouveau des cellules avec le vecteur de clonage purifié (avec les mêmes techniques de transformation présentées précédemment) Cependant, pour que le gène s'exprime dans la

cellule, celui-ci doit être entouré d'un ensemble de signaux que la bactérie (ou tout autre cellule

transformée) devra reconnaître.II. 1. Promoteurs de transcription.Les vecteurs d'expression possèdent un ou plusieurs promoteurs qui doivent être puissants et

aisément régulés. En effet, chaque cellule possède des promoteurs faibles de transcription de

gènes codant pour des molécules requises en faible quantité par la cellule et des promoteurs

forts pour des substances devant être produites en quantité importantes.De plus, l'expression d'un gène peut être induite ou réprimée par la présence d'un composé

spécifique.Un des promoteurs le plus couramment utilisé est le promoteur_Lac qui est la séquence

contrôlant la transcription du gène Lac Z codant pour la ßgalactosidase bactérienne. Ce

promoteur est induit par l'IPTG (voir cours).Il est aussi possible d'utiliser d'autres promoteurs de transcription comme celui du gène de la

tryptophane synthétase (Tryp E).Il est possible d'augmenter la puissance du promoteur par des séries de mutations ou de

délétions dans la séquence promotrice. On arrive alors dans certains cas à obtenir une

efficacité de transcription multipliée par un facteur 10.Le gène de la protéine à exprimer doit donc être clone de telle sorte que sa transcription soit

sous la dépendance de ce promoteur et introduit dans la bonne phase de lecture.Ensuite, l'expression peut être améliorée sous les conditions environnementales qui

normalement activent le promoteur : c'est le cas par addition d'IPTG dans le cas du promoteur

Lac.II. 2. Terminateurs.La présence de terminateurs de transcription à la fin des gènes clones est importante pour

plusieurs raisons : la synthèse de longs transcrits non nécessaires va exiger de l'énergie et des

structures secondaires indésirables peuvent se former dans le transcrit ce qui peut diminuer

l'efficacité de la traduction du coté 5'.IIL Exemple de production : le cas de l'insuline humaine.L'insuline est une hormone peptidique constituée de 2 chaines (A) et (B) reliées par des ponts

disulfures et formées à partir de la préproinsuline par clivage d'une partie de la chaîne

peptidique.

Utilisée pour le traitement des diabètes insulino-dépendants, elle fut tout d'abord extraites du

boeuf (3 acides aminés différents avec l'insuline humaine) puis du porc (un seul acide aminé

différent). Cependant, du fait de ces différences, ces insulines exogènes étaient immunogénes.Le génie génétique a permis de produire de l'insuline humaine à partir de bactéries

génétiquement modifiées.La stratégie expérimentale suivante a été utilisée :1) Isolement du gène de l'insulineL'ARNm codant pour la proinsuiline est isolé de cellules du pancréas. Par utilisation de la

réverse transcriptase, on obtient de l'ADNc puis avec la polymérase, de l'ADNc bicaténaire.

2) VecteurLe plasmide pBR322 portant les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline est choisi

comme vecteur de clonage. Le gène de résistance à la tétracycline contient un site de 6 bases

reconnu par l'enzyme de restriction Bam Hl. Il contient aussi un promoteur puissant, celui de la

(3 galactosidase (P gai) ou celui de tryptophane synthétase (Tryp E).On a commencé par utiliser le promoteur de la p gai mais celui-ci produisant moins d'insuline

que le promoteur Tryp E, c'est finalement ce second promoteur qui a été utilisé.3) Insertion dans le vecteurLe plasmide est ouvert au site Bam HI. L'ADNc codant pour la proinsuline est flanqué de 2

linkers (séquence d'ADN bicaténiare artificiellement ajouté) pour avoir la séquence de

nucléotides appropriée à la ligation (compatibilité). La ligation des 2 molécules d'ADN (vecteurs

et ADNc) se fait par une ligase.4) Hôte : cellule transforméeLe plasmide ainsi modifié est introduit dans une bactérie. La souche choisie est E coli K12

initialement sensible à la tétracycline et à l'ampicilline5) Sélection des clonesLe plasmide pBR322 apporte initialement les 2 résistances à l'ampicilline et à la tétracycline.

Cependant, l'insertion du gène de la proinsuline au site Bam HI du plasmide ne lui permet pas

d'apporté cette seconde résistance à la tétracycline.Ainsi, les colonies bactérienne capable de se développer sur un criilieu contenant de

l'ampicilline sont des bactéries ayant intégrées le plasmide Par réplique (à l'aide d'un papier

buvard) sur un milieu contenant de la tétracycline, on repère alors les colonies d'E. coli qui sont

à la fois résistante à l'ampicilline et sensible à la tétracycline ; Ces dernières sont alors celles

qui ont intégrées le plasmide transformé avec le gène de la proinsuline.6) Vérification de la production de proinsuilineII faut ensuite vérifier que les colonies sélectionnées produisent bien de la proinsuline.Pour cela, on applique sur les colonies choisies une membrane sur laquelle ont été fixés des

anticorps capables de reconnaître la proinsuline. A l'aide d'un second anticorps marqué (méthode indirecte), on détecte alors les clones bactériens capables de produire de la

proinsuline.7) Modification et caractérisation du produitLes clones sélectionnés sont mis à cultiver à grande échelle. Le produit obtenu est purifié puis

convertie en insuline par un mélange de trypsine et de carboxypeptidase BL'insuline est ensuite analysée par HPLC et sa stéreochimie vérifiée. Enfin, des tests de toxicité

et d'activité biologique sont effectués sur animal en mêmes temps que des études

pharmacologiques et cliniques.Autres applications possibles : de nombreuses molécules sont aujourd'hui synthétisées par

génie génétique (vaccins, hormones, vitamines...). Actuellement, une autre voie de d'applications nombreuses sont la création d'organismes transgéniques, organismes dans lesquels on introduit dès les premiers stades embryonnaires des gènes modifiés. Une autre

voie d'application est celle de la thérapie génique qui permettrait d'introduire des gènes sains

dans un organisme contenant des gènes défectueux provoquant des maladies génétiques.quotesdbs_dbs32.pdfusesText_38

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