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Numéro d"ordre 44-2015 Année 2015

THESE DE L"UNIVERSITE

DE LYON

Délivrée par

L"UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

E

COLE DOCTORALE

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE

DIPLOME DE DOCTORAT

(arrêté du 7 août 2006) soutenue publiquement le 23 mars 2015 par

Emmanuelle LEMERY

STRUCTURE ET PHYSICOCHIMIE DES

TENSIOACTIFS, LEURS IMPACTS SUR LA

TOXICITE CUTANEE ET LA FONCTION

BARRIERE

JURY : Mme Marie-Alexandrine BOLZINGER, Université de Lyon (Directeur de thèse)

Mme Stéphanie B

RIANCON

, Université de Lyon (Co-directeur de thèse) Mr Yves CHEVALIER, Université de Lyon (Président du jury)

Mme Arlette B

AILLET-G

UFFROY, Université de Paris-Sud 11 (Rapporteur)

Mr Philippe H

UMBERT, Université de Besançon (Rapporteur)

Mme Amélie BOCHOT, Université de Paris-Sud 11 (Rapporteur)

Mr Thierry ODDOS, JJSBF (Membre invité) " Je suis bien dans ma peau, elle est juste à ma taille ! »

Anonyme

" Il n"y a pas de plus fin, de plus riche, de plus beau tissu que la peau d"une jolie femme. »

Anatole France

Je tiens à remercier chaleureusement Marie-Alexandrine Bolzinger ma directrice de thèse pour son soutien et ses précieux conseils. Au-delà de ses qualités scientifiques, qui ont fait progresser le travail, je n"oublierai pas toutes ces conversations où l"on a refait le monde tard dans la soirée qui ont rendues cette thèse très humaine et plus agréable. Stéphanie Briançon, je vous remercie pour votre encadrement sans faille et votre capacité à tirer le meilleur de mes réflexions scientifiques. Je remercie Yves Chevalier de m"avoir fait l"honneur de présider le jury, mais aussi pour son encadrement, et ses idées pertinentes pour faire avancer le projet. Cette thèse n"aurait jamais vue le jour sans ce trio de choc. Mes remerciements vont aussi à Thierry Oddos, pour m"avoir fait confiance et permis de faire ce travail, de m"avoir guidé sans jamais abandonner ce projet quelle que soit la situation. D"autre part, je remercie Arlette Baillet-Guffrot, Philippe Humbert et Amélie Bochot d"avoir accepté d"être rapporteur de ce travail de thèse. Bien évidemment, je remercie Hatem Fessi de m"avoir accueilli au sein du LAGEP. Je remercie Aurore Rozière et Marek Haftek d"avoir pris le temps d"évaluer mon travail au comité de suivi de thèse et de me conseiller pour l"avancée du projet. Je remercie infiniment, Annie Gohier, mon soutien permanent au sein de Johnson&Johnson, avec de grandes qualités humaines. Tu ne m"as jamais laissé tomber et tu t"es toujours battue pour moi. Sans toi, cette thèse n"aurait pas pu aussi bien se passer et être aussi bien organisée. Je voudrais remercier de tout mon cœur, Jocelyne Pelletier sans qui cette thèse n"aurait pas été aussi agréable. Je ne te remercierais jamais assez pour tout ce que tu as fait pour moi. Tu m"as consacré énormément de ton temps (et je ne parle pas que de l"HPLC, même si on sait toutes les deux que les heures ont été bien longues !). Je ne me lasserais pas de nos conversations où tu as su me rassurer quel que soit mon problème, j"espère avoir su te rendre au moins le quart de tout le soutien que tu m"as donné, ma petite maman du labo. Nous remercions toute l"équipe de Pierre Lantéri : Claire Bordes et Yohann Clément pour leur patience, leur temps, leur accueil chaleureux malgré les difficultés et leur aide précieuse pour analyser les données. Je remercie pour tout le temps et la bonne humeur qu"il m"a accordé à chaque fois, Olivier Boyron, le roi de la spectroscopie infrarouge. Merci également à Odile Damour et Elodie Métral pour m"avoir permis de me procurer sans difficulté des échantillons de peaux humaines essentiels pour l"avancée de ma thèse. Hélène Wong et José Serrano, merci de tout coeur pour m"avoir montré la voie de la toxicologie in vitro, vous avez été présents au moindre souci et vous avez pris le temps de tout m"expliquer. Une grande pensée va vers toutes mes amies et collègues de J&J, grâce à qui les

retours dans l"entreprise étaient un véritable bonheur. Merci à Mélissa, Aurélia, Maude,

Hortense, Leïla ma copine doctorante, Sylvie et Isabelle mes anciennes encadrantes et bien sûr ma moussaka, Anne-Laure, merci pour toute ton amitié. Un immense merci à mes trois stagiaires, j"ai eu la chance d"avoir de véritables perles : Oriane, la spécialiste des ternaires, Charlotte et son tensiomètre à goutte et Augustine la reine des angles de contact. Je voudrais remercier mes amis et collègues de l"université de Lyon qui ont apporté du soleil dans cette thèse : Merci à Nadia, Jean-Pierre et Sébastien pour rendre la vie du labo beaucoup plus facile et agréable. Dorothée, merci pour tes conseils d"ancienne pour la thèse comme pour les TP. Faiza, Zouaoui, merci pour vos conseils et votre amitié. Audrey J, merci pour tous ces bons moment, Skip the Use restera gravé dans ma mémoire ! Pauline, ma grande amie de ma première année de thèse, je pense que grâce à toi, j"ai démarré avec un soutien énorme et je ne te remercierai jamais assez pour ça. Tharwa, Mme HPLC, merci pour tous ces bons moments pendant ma première année de thèse. Raphaël et Eyad, les hommes de Rockefeller, toujours là pour m"aider et discuter, merci

d"avoir été si présents, à Rock comme à l"extérieur pendant les soirées ou congrès ou

soirées de congrès ! Et un merci aux deux hommes du Lagep Fabrice et Barth que j"ai eu plaisir à côtoyer. Les petites " nouvelles » de Rock, Anissa, Alicia, Zoé et ma coloc de bureau Marion, merci de m"avoir supporté pour la dernière ligne droite ! Angèle, merci pour toutes ces petites conversations en mode planchette et battements de jambes à la piscine. Gé, ah... Gé, merci pour tous ces moments, ces discussions autour d"une bière en terrasse, de vin et de fromage chez toi, d"un thé au labo ou simplement pendant le Run in Lyon sous la pluie ! La thèse se termine mais je sais que nos soirées ne sont pas prêtes de disparaitre ! Enfin mes deux petites fées de cette thèse : Charlotte, depuis le premier jour tu m"as supporté dans ton bureau et je suis tellement heureuse d"avoir fait cette thèse rien que pour t"avoir rencontré. J"ai gagné une amie, et je serais toujours là comme tu l"as été pendant ces trois ans, pour tout et n"importe quoi ! Delph, ma binomette, ma running girl, je pense que sans ton soutien et sans ton amitié,

elle aurait été tellement plus difficile cette thèse ! Merci pour tous ces moments passés

avec toi à parler de la thèse, et de nos vies autour de manip, de pâte fimo, d"un bon repas ou en courant quel que soit le temps. Et merci de l"honneur que tu m"as fait en me demandant d"être ta témouine ! Je voudrais aussi remercier mes amis de Lyon qui n"ont jamais vraiment compris sur quoi je travaillais mais qui m"ont rendu la vie lyonnaise plus belle. Les Ragga girls, Marion, Maellie, Marjojo et Sophia, merci pour ces belles soirées de danse. La team Radio Scoop, merci pour tous ces bons moments, en mode raclette, barbeuc, barbeuclette, concert, et quizz du Paddy"s qui m"ont permis de souffler un peu. Mes voisines de choc Kro et Emi, merci pour m"avoir intégrer dès le premier jour dans vos vies et de m"avoir fait rencontrer la team des gazelles ! Les " Sex and the city girls » Lorena et Céline, pour avoir été là dans un moment pas facile, qui est devenu beaucoup plus cool grâce à vous ! Un énorme merci à Bibi aussi ! Estelle, alors tellement merci pour tout, tout, tout bien cordialement, je ne sais pas quoi dire d"autre. Et merci à toutes celles qui ont bien voulu me preter leurs bras pour mes nombreux tests d"hydratation. La science et moi vous remercions d"avoir attendu 4h dans une salle

à 19°C.

Merci à mes amis de presque toujours qui ont su m"écouter dans les moments pas faciles de cette thèse et qui ont su me remonter le moral. Les pharmaciens, Lolita, Clara, Pauline, Benou, Flo, Pierre, JB, Julie et Emi. Les clermontois, Mél, Kéké, G (spéciale dédicace pour le Mont-Blanc, qui m"a fait dire que si j"y étais arrivée, j"arriverais bien à terminer cette thèse), Chris, So, Max, Gui et Vince. Enfin je tiens à remercier de tout mon cœur, ma famille qui me soutien depuis le début

et grâce à qui j"arrive à avancer et à me surpasser. Merci d"être toujours là, à n"importe

quel moment et d"essayer de me montrer toute la confiance que vous avez dans mes capacités, surtout quand je doute. Lioubliou.

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Représentation schématique des principales étapes de la différenciation épidermique

Figure 2. Corps d"Odland vus en microscopie électronique Figure 3. Structure et produits de la transformation de la profilaggrine Figure 4. Réaction de transamidation catalysée par les transglutaminases Figure 5. L"enveloppe cornée proposée par Steinert

Figure 6. Schéma d"un desmosome

Figure 7. Structure chimique des différents composés du sébum Figure 8. Représentation schématique de la formation de l"enveloppe cornée et des corps lamellaires, lipases et lipides intercornéocytaires Figure 9. Synthèse des lipides du ciment intercornéocytaire Figure 10. Organisation des lipides selon les trois directions de l"espace Figure 11. Schéma de l"agencement des lipides de l"espace intercellulaire

Figure 12. Arrangement des lipides en LPP

Figure 13. Organisation conformationnelle et latérale des lipides Figure 14. Schéma de l"arrangement en empilement de monocouche Figure 15. Schéma du modèle mosaïque de Forslind Figure 16. Les différentes conformations possibles des céramides dans le modèle de la phase gel simple Figure 17. Schéma du modèle de phase gel simple proposé par Norlén Figure 19. Régulation de la barrière cutanée Figure 20. Représentation des différents composants du SC Figure 21. Schéma de mesure de la PIE par la méthode de chambre ouverte Figure 22. Spectre infrarouge de peau humaine, réalisé in vivo et zones d"intérêt Figure 23. Analyse d"un spectre infrarouge de la peau Figure 24. Changement de conformation des lipides matriciels en fonction de la température sur un SC humain isolé Figure 25. Spectre įCD2 d"un mélange de DAGL en fonction de la température Figure 26. Schéma explicatif des travaux de Moore et Mendelsohn Figure 27. Méthode d"analyse des spectres par le calcul de FW Figure 28. Chromatogramme HPLC-ELSD des lipides extraits par la méthode in vitro de Folch (chloroforme/méthanol) d"un SC isolé de sein Figure 29. Tracé par un densitomètre d"un chromatogramme sur couche mince des lipides liés du SC humain. Figure 30. Formation d"un angle de contact sur une surface solide Figure 31. Graphique de détermination des composantes polaires et de dispersion de l"énergie de surface du solide Figure 32. Coupe histologique d"un épiderme humain et du modèle SkinEthic TM RHE Figure 33. Réaction chimique pour les Tests MTT et LDH

Figure 34. Puits contenant les inserts de multicouches de kératinocytes traitées par différentes

émulsions et le réactif MTT

Figure 35. Schéma des différents types de tensioactifs Figure 36. Comportement des molécules d"eau à l"interface

Figure 37. Isotherme de Gibbs

Figure 38. Morphologie des agrégats en fonction de la valeur du PAC Figure 39. Organisations des tensioactifs en solution Figure 40. Schéma d"une émulsion huile dans eau ou eau dans huile Figure 41. Dermatite d"irritation de contact chez une serveuse de restaurant collectif liée au travail en milieu humide, plonge, port de gants trop courts laissant pénétrer les détergents Figure 42. Schéma d"une protéine et sites d"action du tensioactif. Figure 43. Mécanisme d"action des tensioactifs ioniques sur le dépliement de la structure protéique Figure 44. Mécanisme d"action des tensioactifs non ioniques sur le dépliement de la structure protéique Figure 45. Image numérique pour la mesure de la tension superficielle d"une huile. Figure 46. Image numérique pour la mesure de la tension interfaciale d"une huile. Figure 47. Protocole de mesure de la tension superficielle. Figure 48. Protocole de mesure de la tension interfaciale Figure 49. Etude cinétique de l"abaissement de la tension superficielle d"une solution de sucrose stéarate à 0.1mg.ml -1 Figure 50. Tension superficielle de la solution en function du log de la concentration en TA (exemple de sucrose stearate)

Figure 51. Distribution de taille des globules d"huile dans un émulsion stabilisée par le Brij S100.

Figure 52. Distribution de taille des globules d"huile dans un émulsion stabilisée par l"Emulium

delta.

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Composition d"1cm

2 de peau Tableau 2. Variation de la composition lipidique durant la différenciation épidermique et la cornification. Tableau 3. Enzymes hydrolytiques de l"espace intercornéocytaire Tableau 4. Structure des différentes classes de céramides existant dans le SC

Tableau 5. Composition chimique moyenne des NMF

Tableau 6. Zones d"intérêt du spectre infrarouge de la peau Tableau 7. Composition des lipides liés du SC humain en pourcentage massique

Tableau 8. Caractéristiques morphologiques de l"épiderme et des modèles de peau reconstruite

Tableau 9. Bilan des tensioactifs et leurs applications en fonction de leur nature

Tableau 10. Tensions superficielles et interfaciales des trois huiles sélectionnées avant et après

purification. Dans son rituel de beauté et d"hygiène, l"homme utilise quotidiennement des produits tels que les savons, gels douche et shampoings mais également les crèmes permettant d"assurer l"hydratation, la protection et la réparation de la peau. Ces formulations ont en commun dans

leur composition un ou des tensioactif ou émulsionnant. En effet, grâce à leurs propriétés

physicochimiques de surface, les tensioactifs sont très utilisés pour la formulation de produits

topiques pour stabiliser les dispersions, telles que les émulsions mais également pour leurs

propriétés moussantes et détergentes dans les produits nettoyants. Ils peuvent également être

utilisés comme promoteur d"absorption dans la peau (Ananthapadmanabhan et al. 2004;

Williams and Barry 2012). Les tensioactifs ont des propriétés solubilisantes des corps gras, à ce

titre ils permettent le nettoyage, mais peuvent également interagir avec les composants de la peau. Une des premières preuves évidentes de l"interaction des tensioactifs avec la peau est

l"observation des signes cliniques suite à l"exposition prolongée ou chronique à des formules

riches en tensioactifs. Ces molécules, maintenant connues pour engendrer des dermatites de

contact d"irritation et des réactions inflammatoires, font l"objet d"un véritable problème de santé

publique concernant les maladies professionnelles liées aux détergents (Crepy 2005; Larson et al. 2006). La bonne santé de la peau repose le plus souvent sur la couche la plus superficielle de l"épiderme: le stratum corneum, assurant une fonction barrière, et protégeant contre les agressions extérieures mais également contre la perte insensible en eau afin de maintenir une bonne hydratation. Grâce aux récentes investigations sur les peaux normales et les peaux

pathologiques, le rôle des lipides du stratum corneum dans la fonction barrière et la perméabilité

de la peau a été mis en avant. De plus, certaines expériences sur la fonction barrière ont montré

une relation très étroite entre la perturbation de la barrière et l"expression de marqueurs d"inflammation. Les nombreuses investigations menées afin de mieux comprendre l"effet des tensioactifs sur la peau ont donc ciblé les lipides cutanés, que ce soit au niveau de leur organisation ou de leur extraction suite au contact avec les tensioactifs. Les protéines de la peau sont également une cible d"étude, les interactions avec les tensioactifs peuvent entrainer leur dénaturation, et engendrer une toxicité. Cependant seuls quelques individus par famille de tensioactif (anionique, cationique et non

ionique) ont été étudiés ; le sodium lauryl sulfate étant reconnu maintenant comme le test positif

d"irritation cutanée. Ainsi des relations entre la structure, les propriétés physicochimiques des

tensioactifs et leur toxicité cutanée ont été établies sur un faible nombre de molécules étudiées.

L"objectif de ce projet de recherche était d"une part d"approfondir les connaissances sur la

physicochimie de certaines classes de tensioactifs peu étudiés et pourtant largement utilisés

dans le milieu industriel puis d"autre part d"évaluer l"impact de la physicochimie du tensioactif sur

sa toxicité cutanée et son effet sur la fonction barrière.

De nombreuses études physicochimiques ont été réalisées au préalable sur les tensioactifs

sélectionnés pour l"étude afin de les caractériser. La toxicité cutanée a été évaluée à l"aide de

techniques in vitro sur épiderme humain reconstruit. L"évaluation de la fonction barrière suite au

traitement par les tensioactifs a été effectuée ex vivo sur explants de peau humaine à trois

niveaux :i/en surface, grâce à la mesure de l"énergie de surface de la peau, ii/au niveau de la

matrice lipidique par observation de l"organisation des lipides grâce à la spectroscopie

infrarouge, et iii/le potentiel d"extraction des tensioactifs a également été évalué par dosage des

lipides par chromatographie liquide haute performance avec détecteur à diffusion de lumière.

L"impact du tensioactif sur la fonction barrière a été relié à sa toxicité cutanée.

La première partie de ce manuscrit est consacrée à une synthèse bibliographique portant sur les

thématiques d"intérêt pour cette étude : La peau, les éléments clefs de la fonction barrière, les

techniques d"évaluation de la peau et de ses propriétés et enfin les caractéristiques physicochimiques des tensioactifs et leur action sur les différents composants de la peau. La

deuxième partie sera dédiée aux résultats expérimentaux regroupés en quatre chapitres

distincts correspondant aux objectifs précédemment exposés. Le premier chapitre traite des

études physicochimiques réalisées sur l"ensemble des tensioactifs puis une étude sur le lien

entre la physicochimie des tensioactifs et leur toxicité cutanée est présentée en deuxième partie.

Le troisième chapitre présente une nouvelle étude sur l"effet des tensioactifs sur la barrière

cutanée à plusieurs niveaux. Le lien entre l"effet des tensioactifs sur la barrière cutanée et leur

toxicité est développé dans le quatrième chapitre. La peau, également appelée système tégumentaire, recouvre tout le corps et représente l"organe le plus important du corps en taille et en poids. La peau représente une masse de 3,5 kg sans le tissu adipeux sous-cutané pour une surface de 2 m 2 environ et une épaisseur moyenne chez l"adulte de 1,2mm (selon les zones

anatomiques considérés, au niveau des paupières ou de la plante du pied, elle peut varier de

0,5 à 4 mm, elle diminue de 6% par décennie). Au niveau de sa constitution on compte 2000

milliards de cellules, 2 millions de pores. Les éléments que l"on peut retrouver dans 1cm 2 de peau figurent dans le Tableau 1.

Tableau 1. Composition d"1cm

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