[PDF] THESE DE DOCTORAT l'Ecole Doctorale Interdisciplinaire de

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UNIVERSITE D"ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée

MUSEUM NATIONAL D"HISTOIRE NATURELLE

Ecole Doctorale Sciences de la Nature et de l"Homme - ED 227 Année 2009 N° attribué par la bibliothèque |_|_|_|_|_|_|_|_|_|_|_|_|

THESE DE DOCTORAT

en Sciences de la Vie - Spécialité : Biochimie Etudes chimiques et toxicologiques de deux plantes toxiques malgaches :

Dioscorea antaly Jum. & Perr. (DIOSCOREACEAE) et

Rhodocodon madagascariensis Baker (HYACINTHACEAE)

Présentée et soutenue publiquement par :

Lolona RAKOTOBE-RANDRIAMOELIARIVONY

Maître ès Sciences

le 30 octobre 2009

Composition du jury :

RALAMBORANTO Laurence, Professeur titulaire Président RAZANAMPARANY Julia L., Professeur titulaire Rapporteur

COMTE Gilles, Professeur titulaire Rapporteur

MAMBU Lengo, Maître de Conférences HDR Examinateur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel, Professeur titulaire Examinateur BODO Bernard, Professeur titulaire Directeur de thèse JEANNODA Victor, Professeur titulaire Directeur de thèse Ce travail de thèse en co-tutelle a été réalisé :

• au Muséum National d"Histoire Naturelle de Paris, dans l"unité MCAM (Molécules de

Communication et Adaptation des Micro-organismes) FRE 3206 CNRS/MNHN, au sein des équipes de recherche CBAF (Chimie Bio-organique des Associations Fongiques) ancienne unité " Chimie et Biochimie des Substances Naturelles (UMR 5154 CNRS/MNHN) », et, CCE

(Cyanobactéries, Cyanotoxines et Environnement) ancienne unité " Ecosystèmes et Interactions

toxiques (USM 505 MNHN) ».

• à l"Université d"Antananarivo, dans le département de Biochimie Fondamentale et

Appliquée de la Faculté des Sciences, au sein du Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences

Médicales (LABASM).

Je dédie cette thèse à mes proches. De tout mon coeur je vous remercie et sachez que le mérite de cette thèse, à laquelle vous aviez contribué avec amour et affection, est aussi le vôtre. La grâce de Dieu m"a permis de réaliser et d"achever ce travail, aussi je Le loue pour son Amour : " Seigneur, Tu es mon Dieu, je t"exalte et célèbre Ton Nom, car Tu as réalisé des projets merveilleux, conçus depuis longtemps, constants et immuables ». (Esaïe 25 : 1)

REMERCIEMENTS

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à : - Madame le Professeur Laurence Ralamboranto, Président du jury - Madame le Professeur Louisette Razanamparany, rapporteur - Monsieur le Professeur Gilles Comte, rapporteur - Madame le Docteur Lengo Mambu, examinateur - Monsieur le Professeur Abel Andriantsimahavandy, examinateur

qui, malgré leurs nombreuses obligations, malgré l"éloignement pour certains d"entre eux, me font

l"honneur d"apporter leurs compétences dans le jugement de ce travail. Je témoigne ma gratitude à l"égard de mes deux directeurs de thèse : - Monsieur le Professeur Victor Jeannoda, chef du département de biochimie fondamentale et

appliquée et responsable de la formation doctorale au sein de la Faculté des Sciences

d"Antananarivo, pour m"avoir initiée à la recherche et encouragée à poursuivre après le DEA. Il

a tout mis en oeuvre pour mettre en place cette thèse en co-tutelle et trouver des sources de financement pour mes nombreux séjours au MNHN. Il m"a dirigée et soutenue efficacement

tout le long de ces années de travail et j"ai pu bénéficiée de sa riche expérience dans de

nombreux aspects de la recherche ; - Monsieur le Professeur Bernard Bodo, ancien directeur du laboratoire de chimie et biochimie des substances naturelles du MNHN, pour avoir rendu cette thèse en co-tutelle possible par la

confiance qu"il a manifestée à mon égard en acceptant de diriger cette thèse et d"avoir si

activement facilité mes séjours à Paris, pour son accueil, son aide précieuse et ses

encouragements lors de mes travaux de recherche au MNHN et surtout lors de la rédaction, malgré l"éloignement.

Mes chaleureux remerciements vont à toute l"équipe du LABASM et tout particulièrement à :

- Madame le Docteur Danielle D. A. Rakoto pour m"avoir accueillie dans l"unité de toxicologie

qu"elle dirige, pour m"avoir aidée et conseillée, tant sur le point scientifique que rédactionnel,

et pour la sollicitude qu"elle a toujours manifestée à mon endroit tout au long de ces années de

recherche passées au laboratoire ;

- Monsieur le Docteur Ranjàna H. Randrianarivo pour sa gentillesse exemplaire, sa serviabilité et

son aide inestimable tant au laboratoire que sur le terrain. Mes vifs remerciements aux chercheurs du MNHN notamment : - au Docteur Lengo Mambu pour tout ce qu"elle a fait sur le plan scientifique et administratif - au Docteur Marc Edery, directeur de recherches INSERM, pour sa collaboration efficace dans les travaux sur le " médaka » - à Miassa Berkal pour sa contribution dans la réalisation des tests sur le " médaka » - à Monsieur et Madame le Professeur Claude Marcel Hladik, directeur de recherches émérite, pour tout ce qu"ils ont fait pour faciliter mes séjours au MNHN - à toute l"équipe de l"unité MCAM FRE 3206 CNRS/MNHN dirigée par Madame le Professeur

Sylvie Rebuffat en particulier à :

- Bastien Nay, responsable de l"équipe de recherche CBAF, pour ses suggestions et conseils ; - Alexandre Deville et Alain Blond du Service de RMN pour la réalisation des spectres RMN ; - Lionel Dubost et Arul Marie de la plateforme de spectrométrie de masse pour les spectres de masse ; - Soizic Prado pour les tests antimycobactériens ; - Gerard Gastine et Manon Vandervennet du service de bactériologie pour les tests antibactériens ; - Arlette Longeon pour les tests anti-inflammatoires ; - Roger Joyeau pour ses conseils et aides mais également pour les discussions enrichissantes et amicales ; - Christel Edmond et Catherine Pougault pour les questions administratives.

Ma gratitude s"adresse au Professeur Catherine Lavaud et à toute son équipe de m"avoir accueillie

dans leur laboratoire de l"Institut de Chimie Moléculaire de Reims. Je ne saurais ne pas exprimer ma reconnaissance à : - Madame le Docteur Clara Rajemiarimoelisoa pour son aide précieuse dans la réalisation des études anatomopathologiques et pour les discussions enrichissantes dans le domaine - Madame le Professeur Vololoniaina H. Jeannoda pour m"avoir partagé ses connaissances sur les Dioscorea.

Je tiens à remercie vivement les institutions qui ont financé mes voyages et séjours en France à

savoir :

- le Service de Coopération et d"Action Culturelle (SCAC) de l"Ambassade de France à

Madagascar,

- l"Ecole Doctorale Interdisciplinaire de Madagascar (EDIM) - le Groupement de Recherches Internationales (GDRI) J"exprime mes reconnaissances aux responsables et personnel de ces institutions pour leur implication dans ce travail. A tous les amis que je me suis faite au LABASM, Lovarintsoa J. Randriamampianina et Franck Yvon Rasoloharijaona ainsi que tous les autres et ceux du laboratoire de chimie du MNHN, Hichem Henchiri, Marion Girardot, Lorena Albernaz et Damien Lacroix, pour leur soutien et les bons moments passés ensemble. Un grand merci à Madame Iolivaharibodo Rakotomahandry pour m"avoir accueillie si gentiment chez elle lors de mes derniers mois de stage à Paris.

A tous ceux qui m"ont consacré un peu de leurs précieux temps, et m"ont aidé d"une manière ou

d"une autre, je vous suis très reconnaissante et vous remercie.

GLOSSAIRE

Ataxie : incoordination des mouvements avec conservation de la force musculaire.

Clastogène : se dit d"une substance chimique qui occasionne une aberration chromosomique

structurelle (anticlastogène : substance contrant l"effet clastogène).

Colite : inflammation du côlon.

Enophtalmie : enfoncement des globes oculaires.

Erysipèle : infection aiguë de la peau due à un streptocoque, caractérisée par une plaque rouge

douloureuse et de la fièvre. Gastrite : inflammation de la muqueuse de l"estomac. Glomérulite : variété de maladie des reins atteignant électivement les glomérules.

Hydropisie : épanchement de sérosité dans une cavité naturelle du corps ou entre les éléments du

tissu conjonctif. Hyperplasie : prolifération anormale des cellules d"un tissu. Hyperpnée : augmentation de la fréquence respiratoire. Imbibition oedémateuse : imprégnation ou infiltration séreuse d"un tissu. Infarcissement : formation d"un infarctus dans un organe.

Myocardite : inflammation du myocarde.

Néphrite : inflammation du rein.

Péricardite : inflammation du péricarde.

Piloérection : érection des poils.

Stéatose : infiltration ou dégénérescence graisseuse d"un tissu ou d"un organe.

LISTE DES ABREVIATIONS

ACN : acétonitrile

AcOEt : acétate d"éthyle

ADN : acide désoxyribonucléique

CCM : chromatographie sur couche mince

CD3OD : méthanol deutérié

CDCl3 : chloroforme deutérié

CH2Cl2 : dichlorométhane

CI50 : concentration provoquant 50% d"inhibition

CMI : concentration minimale inhibitrice

COSY : " COrrelation SpectroscopY » spectroscopie de corrélations d : doublet dd : doublet de doublet ddl : doublet de doublet large dl : doublet large

DDT : dichlorodiphényltrichloroéthane

DL50 : dose létale 50%

ESI : "ElectroSpray Ionisation" Ionisation par électronébulisation

EtOH : éthanol

HMBC : "Heteronuclear Multiple Bond Correlation"

HPLC : "High Performance Liquid Chromatography" Chromatographie liquide à haute performance

HSQC : "Heteronuclear Single Quantum Coherence"

J : constante de couplage

j : jour m : multiplet

MeOH : méthanol

MPLC : "Medium Pressure Liquid Chromatography" (Chromatographie liquide à moyenne pression)

NOESY : "Nuclear Overhauser Effect spectroscopY"

ppm : partie par million

Pyr-d5 : pyridine deutérié

Rdt : rendement

RMN 2D : résonance magnétique nucléaire à deux dimensions

RMN : résonance magnétique nucléaire

s : singulet sl : singulet large

TFA : acide trifluoroacétique

UI : unité internationale

LISTE DES FIGURES

Figure 1

: Les deux types de squelette d"aglycones. 15

Figure 2

: Structure de la dioscine et de la diosgénine. 16

Figure 3

: Structure de la protodioscine. 16

Figure 4

: Structure des dioscorésides A et B. 17

Figure 5

: Structures de dioseptemlosides E et G. 17

Figure 6

: Structure de la dumétorine. 18

Figure 7

: Structure de la dioscorine. 19

Figure 8

: Structure de la crinamine 19

Figure 9

: Structures des diosbulbines A, B et C. 19

Figure 10

: Structure des diosbulbines D-H. 20

Figure 11

: Structures des diosbulbinosides D et F. 20

Figure 12

: Structure des bafoudiosbulbines A, B, D, F et G. 21

Figure 13

: Structures de quelques stilbènes isolés des Dioscorea. 22

Figure 14

: Structures d"un phénanthrène et d"un dihydrophénanthrène isolés de

Dioscorea. 22

Figure 15

: Structures des hydroxyphénanthrènes isolés de Dioscorea opposita, 3,4,6- trihydroxyphénanthrène (C) et 6,7-dihydroxy-2-méthoxy-1,4-phénanthrènedione (E), de la dioscorone A (D). Structures de la phénanthraquinone, diocoreanone (E) et des naphtofuranoxépines, dioscorealides A (G) et B (EH) isolées de D. membranacea. 23

Figure 16

: Dioscorea antaly Jum. & Perr. 31

Figure 17

: Carte de répartition de Dioscorea antaly Jum. & Perr. 33

Figure 18

: Résumé des différentes étapes d"extraction par les solvants organiques. 37

Figure 19

: Les différentes étapes menant à l"obtention des trois produits nouveaux (D5 : antadiosbulbine A, et D6 : antadiosbuline B et D12 : 8-épidiosbulbine G) 39

Figure 20

: Schéma d"isolement des constituants de l"extrait par AcOEt. 40

Figure 21

: Procédé de purification de l"extrait brut aqueux. 41

Figure 22

: Sous-structures a, b, c et d déduites du spectre 1H-1H COSY du composé

D11. 43

Figure 23

: A : Principales corrélations observées dans le spectre HMBC entre les sous- structures a, b, c et d ; B : Structure plane du composé D11 ; C : Principaux NOEs observés dans le spectre NOESY de D11. 45

Figure 24

: 8-épi-diosbulbine E (D11). 46

Figure 25

: Structure de la 6-O-acétyl-8-épidiosbulbine E. 49

Figure 26

: Sous-structures a, b, c et d déduites du spectre 1H-1H COSY du composé

D7. 51

Figure 27 : A : Structure plane du composé D7 ; B : Principaux NOEs observés dans le spectre NOESY. 52

Figure 28

: Diosbulbine E (D7). 53

Figure 29

: A : Corrélations HMBC et structure plane du composé D12 ; B : Principaux NOEs observés dans le spectre NOESY du composé D12. 55

Figure 29C

: 8-épidiosbulbine G (D12). 56

Figure 30

: Sous-structures a, b, c et d déduites du spectre 1H-1H COSY du composé

D5. 59

Figure 31

: Antadiosbulbine A. A : Corrélations HMBC permettant d"assembler les sous-structures a-d issues du H-H COSY de D5 ; B : Structure plane du composé D5. 60

Figure 32

: A : Sélection de corrélation NOE observées sur le spectre NOESY de l"antadiosbulbine A (D5) ; B : Structure de l"antadiosbulbine A. 61

Figure 33

: Sous-structures a-d identifiées à partir du spectre H-H COSY et assemblage de ces sous-structures par analyse des corrélations observées sur le spectre HMBC pour aboutir à la structure plane proposée pour le composé D6. 63

Figure 34

: Antadiosbulbine B. A : Sélection de corrélations NOE observées sur le spectre NOESY de l"antadiosbulbine B (D6) ; B : Structure de l"antadiosbulbine B. 65

Figure 35

: Structures des squelettes labdane et clérodane. 65

Figure 36

: Schéma simplifié et hypothétique pour la biosynthèse des diosbulbines E, G ,de l"antadiosbulbine A et de leurs épimères en C-8. 67

Figure 37

: Structure du composé D13 : 5,7,4"-trihydroxyflavone-3-O-b-D- glycopyranosyl(6-1)-a-L-rhamnose. 68

Figure 38

: Structure du composé D14 : kaempférol. 69

Figure 39

: Structure du composé D15 : quercétine. 70

Figure 40

: Structure du composé D16 : isorhamnétine. 71

Figure 41

: Structure du composé D8 : catéchine. 72

Figure 42

: Sous-structures a, b et c déduites du spectre COSY. 73

Figure 43

: Structure du composé D1 : 3,7-dihydroxy-2,4-diméthoxyphénanthrène. 74

Figure 44

: Sous-structures a, b et c déduites du spectre 1H-1H COSY de D3. 75

Figure 45

: Structure de D3 : hydroxy-3-resvératrol ou picéatannol. 76

Figure 46

: Sous-structures a, b et c déduites du spectre 1H-1H COSY de D2. 77

Figure 47

: Structure de D2 : dihydro-7,8-hydroxy-3-resvératrol ou dihydropicéatannol. 78

Figure 48

: Sous-structures a, b, c et d déduites du spectre 1H-1H COSY de D10. 79

Figure 49

: Structure du composé D10 : cassigarol D. 80

Figure 50

: Sous-structures a-f déduites du spectre 1H-1H COSY de D9. 81

Figure 51

: Assemblage des sous-structures a-f à l"aide des corrélations du spectre

HMBC de D9. 82

Figure 52

: Structure de D9 ou scirpusine B. 83 Figure 53 : Relations biosynthétiques plausibles entre les stilbènes isolés de Dioscorea antaly Jum. & Perr. 84

Figure 54

: Coupes histologiques de a) cerveau non traité b) cerveau traité par l"extrait à 5 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 72 h. 91

Figure 55

: Coupes histologiques de a) cerveau non traité b) cerveau traité par l"extrait à 1,3g/kg par voie intra-péritonéale après un temps d"exposition de 24 h. 91

Figure 56

: Coupes histologiques de a) poumon non traité b) poumon traité par l"extrait à 5 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 72 h. 92

Figure 57

: Coupes histologiques de a) poumon non traité b) poumon traité par l"extrait à 5 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 72 h. 92

Figure 58

: Coupes histologiques de a) coeur non traité b) coeur traité par l"extrait à 12 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 72 h. 93

Figure 59

: Coupes histologiques de a) coeur non traité b) coeur traité par l"extrait à 1,3 g/kg par voie intra péritonéale après un temps d"exposition de 72 h. 93

Figure 60

: Coupes histologiques de a) rein non traité b) rein traité par l"extrait à 12 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 72 h. 94

Figure 61

: Coupes histologiques de a) rein non traité b) rein traité par l"extrait à 1,3 g/kg par voie intra péritonéale après un temps d"exposition de 24 h. 94

Figure 62

: Coupes histologiques de a) estomac non traité b) estomac traité par l"extrait à 12g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 24 h. 95

Figure 63

: Coupes histologiques de a) estomac non traité b) estomac traité par l"extrait à 1 g/kg par voie intra-péritonéale après un temps d"exposition de 72 h. 95

Figure 64

: Coupes histologiques de a) foie non traité b) foie traité par l"extrait à 12 g/kg par voie orale après un temps d"exposition de 24 h. 96

Figure 65

: Coupes histologiques de a) foie non traité b) foie traité par l"extrait à 1,3 g/kg par voie intrapéritonéale après un temps d"exposition de 24 h. 96

Figure 66

: Coupes histologiques de a) intestin non traité b) intestin traité par l"extrait à

1,3 g/kg par voie intrapéritonéale après un temps d"exposition de 24 h. 97

Figure 67

: Coupes histologiques de a) intestin non traité b) intestin traité par l"extrait à

1,3 g/kg par voie intrapéritonéale après un temps d"exposition de 24 h. 97

Figure 68

: Courbes des totaux cumulatifs permettant la détermination de la DL50 (24 h) par la méthode de Reed et Muench (1938). 98

Figure 69

: Courbe effet-dose de l"extrait brut aqueux de Dioscorea antaly Jum. & Perr. par administration par voie orale et sa droite de régression linéaire. 99

Figure 70

: Courbes des totaux cumulatifs permettant la détermination de la DL50 (24quotesdbs_dbs18.pdfusesText_24

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